[发明专利]一种含有水蛭或地龙成分的中药制剂的生物活性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药制剂的质量检测方法，确切的说，本发明涉及一种含有水蛭或地龙药材成分的中药制剂的生物活性测定方法，该方法可用于产品的质量控制。

背景技术

水蛭是一味传统的中药，始载于《神农本草经》，中医认为它具有破血、逐瘀、通经的作用。历来用于治疗症瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤。水蛭中的水蛭素是作用最强的凝血酶特异性抑制剂，它不仅能阻止纤维蛋白原的凝固，也可阻止凝血酶催化的进一步血瘀反应，如凝血诱导的血小板反应等。由于水蛭素能有效地抑制游离的和凝血块上的凝血酶，因此可用以防止各类血栓的形成及延伸。研究证明，水蛭药材经不同的提取工艺后，其抗凝活性不仅存在于水蛭素，部分的小分子成分也具有抗凝作用，这类成分的中药制剂如疏血通注射液等。

地龙也是一味传统中药，具有清热、定惊、通络、平喘及利尿等多种功效。现代研究表明，地龙含有丰富的酶类，其中纤维蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓胶质酶对体内凝血和纤溶系统具有广泛的影响。贺石林等(地龙提取液的抗凝作用与毒性[J].湖南医科大学学报，1990，(2)：107-111)发现地龙水煎醇提取液在动物体内外均有抗凝血活性，经初步化学分离认为抗凝活性成分可能是耐热的小肽类成分，并排除了蛋白质、多糖、核酸类大分子的可能。含有地龙成分的中药制剂如复方地龙胶囊、脑心通胶囊等临床广泛用于脑中风等疾病的防治。

含有水蛭或地龙药材的中药制剂多具有抗凝、溶栓、细胞保护等多方面生理活性，临床上多用于心脑血管相关疾病的防治。目前，对于这类中药制剂还没有很好的生物活性测定方法。国家药典2010版所用的水蛭药材抗凝活性测定方法采用凝血酶滴定法，计时和肉眼鉴别滴定终点，误差大且容易受实验者操作手法影响。本发明采用荧光共振能量转移(FRET)方法来测定凝血酶的抑制作用可反映含有水蛭或地龙药材成分的药物制剂的抗凝活性，采用荧光仪自动仪器读数，方法简便快速，误差小，重现性高，较药典方法具有很大优势。

凝血酶是由凝血酶原活化变成的一种专一性很强的丝氨酸蛋白类水解酶，是机体凝血系统中的天然成分。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在凝血过程中，凝血酶原复合物将其激活而转变为有丝氨酸蛋白类水解活性的凝血酶。凝血酶的形成在凝血过程中起到了中心作用。凝血酶特异性的剪切一些肽类底物如S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl)等已有文献报道(Abildgaard U，Lie M， OR.Antithrombin(heparin cofactor)assay with″new″chromogenic substrates(S-2238and Chromozym TH).Thromb Res.1977Oct；11(4)：549-53.)。

发明内容

本发明的目的是克服现有含水蛭或地龙药材的中药制剂生物活性测定方法的不足，提供一种新的生物活性检测方法，以控制产品的质量。

本发明提供的测定含水蛭或地龙药材的中药制剂抗凝血酶生物活性测定方法，主要包括以下步骤：

(1)配制制剂供试品溶液：对于注射剂，可直接取注射液作为供试品溶液，注射用粉针剂可以采用生理盐水溶解后作为供试品溶液，固体制剂可以采用适当方法提取活性成分后，用水、生理盐水或缓冲液溶解后作为供试品溶液。

(2)制备反应溶液：依次在96孔荧光测定板中加入37℃预热的测试缓冲液、生理盐水、供试品溶液、凝血酶，混匀即得反应溶液。

(3)测定荧光密度：将上述加好溶液的96孔荧光板37℃预热15min，加入凝血酶底物溶液50μl，Ex/Em=485nm/535nm立即测定荧光密度(RFU)，测定持续30min，每间隔5min记录数据。

所述步骤(1)中固体制剂的供试品配制方法为精密称取固体制剂0.1～10g，采用水、生理盐水或甲醇、乙醇溶液提取，提取方式可以采用浸泡、加热提取或超声提取，提取液减压浓缩至干燥，用水、生理盐水或Tris缓冲液溶解后作为供试品溶液。

所述步骤(2)中反应溶液的制备方法为在96孔荧光测定板中每孔加入供试品溶液10～90μl，纯化的凝血酶20～200ng或5mU～5U，测试缓冲液或生理盐水至总体积100μl。测试缓冲液可以采用pH6-8范围内的0.01～5M Tris缓冲液。

所述步骤(3)中凝血酶底物为荧光标记的小肽，荧光标记物可以为生物素或FITC等荧光染料，小肽核心氨基酸序列为Phe-Pro-Arg或文献报道的其他序列，荧光底物的浓度为0.1-100μM。