[发明专利]一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法

权利要求书

1.一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于无需对地龙品种进行形态学鉴定，可以快速、准确的鉴定药用地龙品种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于可以区分鉴定广地龙和沪地龙品种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于可以区分鉴定沪地龙，包括通俗环毛蚓、威廉环毛蚓和栉肓毛蚓。

4.根据权利要求1所述的方法为DNA条形码分子鉴定方法，其步骤主要包括：

(1)从待测的地龙样品组织中分离提取基因组DNA；

(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板用一对引物，通过聚合酶链式反应扩增；

(3)然后取适量步骤(2)的聚合酶链式反应扩增出DNA产物用琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，送生物测序公司测序；

(4)将测序结果进行拼接，与所述基因序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4的同源性进行比对，同源性在99％以上，即可判断鉴定地龙品种。

5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于引物DNA的序列为：

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

6.根据权利要求4所述聚合酶链式反应，其特征在于扩增条件为94℃预变性1分钟，45℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，5个循环；94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。

7.根据权利要求4所述扩增产物，其特征在于扩增片段为709bp，用1％-2％琼脂糖电泳检测。

8.根据权利要求4所述的地龙DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为COI基因，具有如下所述的广地龙参环毛蚓基因序列SEQ ID NO.1：AACACTATACTTCATTTTAGGAATTTGAGCTGGAATAATTGGAGCAGGTATAAGACTCCTTATTCGAATTGAACTAAGACAACCGGGCTCATTCCTGGGCAGAGATCAACTATATAACACAATTGTCACTGCTCATGCATTCTTAATAATTTTCTTTCTAGTTATACCAGTATTCATTGGAGGATTTGGAAATTGACTTCTTCCTCTAATACTCGGAACGCCAGATATAGCATTCCCACGACTTAATAATATAAGATTTTGACTTTTACCACCCTCTCTAATTCTATTAGTATCTTCTGCCGCTGTGGAGAAAGGAGCAGGAACCGGATGAACAGTATATCCACCCCTAGCAAGAAATATTGCGCATGCTGGACCATCTGTGGACCTCGCAATTTTTTCCCTTCACTTAGCGGGGGCATCATCTATCCTTGGAGCTATCAACTTTATTACCACAGTAATTAATATACGTTGATCAGGTCTACGACTAGAACGAATTCCACTATTTGTATGAGCAGTAGTAATTACTGTAGTCCTACTACTTCTATCCCTACCAGTACTCGCGGGGGCTATTACAATACTTCTAACAGATCGAAACCTAAATACATCTTTCTTCGACCCAGCCGGTGGAGGAGATCCAATTCTATATCAACATCTATTC。