[发明专利]一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及地龙的DNA条形码分子鉴定方法。

背景技术

地龙，即蚯蚓，性寒，味微咸，是传统的中药材，而《中华人民共和国药典》2010年版(一部)“地龙”项下收载的仅有环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蚓(Pheretima vulgaris Chen)、威廉环毛蚓(Pheretima.guillelmi(Michaelsen))或栉肓毛蚓(Pheretima pectinifera Michaelsen)的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”。地龙在《神农本草经》被列为下品，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高热、神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肺热喘咳、尿少水肿、高血压等症。李时珍在《本草纲目》称之为具有通经活络、活血化瘀、预防治疗心脑血管疾病作用。现代研究表明，地龙含有多种药理活性成分，药理作用几乎涉及人体各个系统，主要有抗血栓、溶栓和平喘、抗心律失常、降压、增强免疫、抗溃疡、解热、消炎、镇痛、免疫调节、促进创面愈合、镇静、抗肿瘤等多方面的药理作用，临床应用非常广泛。

对地龙品种的鉴定是入药的基础，目前中药材地龙的鉴定大多采用的是活体鉴别的方法，主要依据其外部形态和内部构造。但是由于动物类药材大多外部形态相似，组织特征无特异性，而且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出物种本身的形状和颜色，显微特征也有不同程度的破坏，造成地龙干品鉴别比较困难。因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶1号基因(COI)的部分序列。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。运用DNA条形码技术，可以很好的对广地龙和沪地龙的品种进行快速、有效的鉴定。

本发明提供一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法，无形态学观察，可以快速准确鉴定《中华人民共和国药典》规定的地龙品种和非药材地龙品种，保证中药原材料的安全性。

发明内容

本发明克服目前以形态学鉴定地龙方法存在的缺陷，提高地龙鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本发明的技术方案如下：

首先从采集的地龙样品提取基因组DNA，利用一对引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出样品一段COI基因，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立广地龙和沪地龙的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析聚合酶链式反应的产物结果，根据COI基因序列的差异，从而达到快速、准确鉴定地龙物种的目的。本发明设计的用于《中华人民共和国药典》规定的地龙品种和非药材地龙品种鉴定方法，采用如下步骤：

1、提取地龙基因组DNA：按常规动物DNA提取方法或者血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/μl-2μg/μl。

2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′：

扩增程序为94℃预变性1分钟，45℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，5个循环94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环72℃延伸5分钟。

3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNAmarker检测PCR片段大小。

4、鉴定结果的判断：若出现明显清晰的709bp大小的条带，且无杂带，则可送生物测序公司测序。

5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4，如果与任一序列同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为上述种属。

其中，所述的地龙DNA条形码分子鉴定方法采用的是血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。

所述引物：