[发明专利]一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法

权利要求书

1. 一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按重量百分比称取喜树碱原药0.1-1.5%，氢氧化钠2-9%，水89-98%，反应温度控制在45-65℃下不断搅拌至完全溶解，配制成喜树碱溶液，备用；

2）将步骤1）中的喜树碱溶液稀释至900-1200倍，取1-5μL喷雾或饲喂处理昆虫，每隔10-15h处理一次，共处理3-7天至虫体出现慢性中毒症状直至濒临死亡为止，再用2-8μL浓度为1.2-1.5%的盐酸溶液喷雾或浸渍昆虫2-5min，使其充分浸润，最后365-430nm波长下置于荧光显微镜下观察，荧光区域即为喜树碱的沉积部位，解剖分离喜树碱沉积部位，然后将该部位的大量细胞迅速置于-70℃冰箱中冷冻30-50min，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理7-15min，使其充分释出蛋白质等细胞液，再将细胞液9000-12000rpm、2-9℃离心11-19min，过滤弃沉淀，保留上清液，备用；

3）将处理后的上清液，通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈－水溶剂系统梯度洗脱2-5次，即可精准定位出喜树碱与虫体细胞相结合的靶蛋白。

2. 如权利要求1所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于所述的喜树碱原药含量为0.3-1.2%，优选0.5-1.0%，更优选0.7-0.9%。

3. 如权利要求1所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于所述氢氧化钠的含量为4-8%，优选5-6%。

4. 如权利要求1所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于水含量为90-95%。

5. 如权利要求1所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于步骤1）中：喜树碱水剂配制温度为50-60℃，优选55-58℃。

6. 如权利要求1所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于步骤2）中：喜树碱溶液稀释倍数为950-1150倍，优选1000-1100倍；细胞冷冻时间为35-45h，优选38-42h；离心转速优选10000-11000rpm，离心温度优选3-7℃，离心时间优选12-17min，波长为380-400nm。