[发明专利]一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法

说明书

技术领域

本发明属于生物农药工程技术领域，具体为一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法。

背景技术

植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过 40万种，其中的大多数化学物质如萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、独特的氨基酸和多糖等均具有杀虫活性。喜树(Camptothecia acuminata Decaisne) 别名：旱莲木、水桐树，是我国特有树种，分布于浙江、福建、江西、四川、云南等省区，在四川西部成都平原和江西东南部均较常见，属山茱萸目珙桐科。其所含有抗肿瘤作用的生物碱———喜树碱（CPT）分子式为C₂0H₁₆N₂O₄，相对分子质量348.34，具有抗癌、清热杀虫的功能。

喜树碱没有明显的碱性，属于中性生物碱，不溶于酸，与酸不易成盐，所以不能用生物碱常规的提取方法分离。研究发现CPT能够阻断拓朴异构酶I的合成，CPT阻断这种酶的产生即可阻止癌细胞的生长，临床研究表明，CPT对各种移植的动物肿瘤及移植于裸鼠身上的胃癌和大肠癌均有显著疗效。目前张立钦等研究发现CPT对蚜虫、小绿叶蝉、水稻二化螟和稻飞虱等均具有较高的杀虫活性。 但是由于化合物的不同光学异构体在生物活性和作用靶点上都有可能不同。早期的研究表明喜树碱作为一种拓朴异构酶Ⅰ抑制剂，能够阻断这种酶的产生，同时抑制肿瘤细胞的正常运转，而关于植物源农药其在害虫体内如何发挥杀虫活性的作用机理却未见相关报道。

张立钦等前期室内研究发现喜树碱可以干扰试虫的正常生长发育，田间试验过程中亦观察到喜树碱药剂可使害虫出现摇头、麻痹、最终死亡的现象。本发明可以精准定位出喜树碱作用的虫体细胞靶蛋白，从而为研究生物农药对害虫的致毒机理提供了可能，通过精准定位生物碱作用的具体部位，可为植物源药剂毒理学研究和新药的开发提供理论和技术支持。

 

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法的技术方案，以植物体内天然存在的物质喜树碱为研究对象，利用喜树碱的荧光性，构建测定喜树碱与虫体细胞蛋白结合部位的定位方法；其建立的技术可快速、准确测定生物碱类在细胞中的沉积部位，具有精确度高，稳定性好等特点，解决了目前植物源农药活性成分作用机理研究中不能快速找到受体蛋白的问题，可为生物农药的机理研究提供一定参考，为植物源药剂毒理学研究和新药的开发提供理论和技术支持。

所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于包括以下步骤：

1）按重量百分比称取喜树碱原药0.1-1.5%，氢氧化钠2-9%，水89-98%，反应温度控制在45-65℃下不断搅拌至完全溶解，配制成喜树碱溶液，备用；

2）将步骤1）中的喜树碱溶液稀释至900-1200倍，取1-5μL喷雾或饲喂处理昆虫，每隔10-15h处理一次，共处理3-7天至虫体出现慢性中毒症状直至濒临死亡为止，再用2-8μL浓度为1.2-1.5%的盐酸溶液喷雾或浸渍昆虫2-5min，使其充分浸润，最后365-430nm波长下置于荧光显微镜下观察，荧光区域即为喜树碱的沉积部位，解剖分离喜树碱沉积部位，然后将该部位的大量细胞迅速置于-70℃冰箱中冷冻30-50min，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理7-15min，使其充分释出蛋白质等细胞液，再将细胞液9000-12000rpm、2-9℃离心11-19min，过滤弃沉淀，保留上清液，备用；

3）将处理后的上清液，通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈－水溶剂系统梯度洗脱2-5次，即可精准定位出喜树碱与虫体细胞相结合的靶蛋白。

所述的喜树碱原药可以由四川锶全天然产物有限公司购得。

所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于所述的喜树碱原药含量为0.3-1.2%，优选0.5-1.0%，更优选0.7-0.9%。

所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于所述氢氧化钠的含量为4-8%，优选5-6%。

所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于水含量为90-95%。

所述的一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于步骤1）中：喜树碱水剂配制温度为50-60℃，优选55-58℃。