[发明专利]一种水蛭的DNA条形码分子鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种宽体金线蛭DNA条形码分子鉴定方法。 

背景技术

宽体金线蛭(学名：Whitmania pigra)是传统的名贵中药材，是2010版《中国药典》收录的药材水蛭主要基原动物之一，具有破瘀通经，消积散结等功效，也是疏血通等众多治疗心脏血管疾病中药的主要原料。因此，对宽体金线蛭的鉴定是入药的基础。在我国的药材市场，大部分动物药都是贵重、紧缺药材，通常以粉末等形式入药，市场较为混乱，鉴别十分困难。至于水蛭，在药材市场上，来源相对清晰，但是仍有部分伪品在市场内流通。目前，传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差，可信度低，导致水蛭的鉴定存在很大困难，因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。 

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶1号基因(COI)的部分序列。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。运用DNA条形码技术，可以很好的对水蛭的品种进行快速、有效的鉴定。 

本发明提供一种关于宽体金线蛭DNA条形码分子鉴定的方法，有利于实现宽体金线蛭的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。 

发明内容

本发明克服目前以形态学鉴定水蛭方法存在的缺陷，提高宽体金线蛭鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本发明的技术方案如下： 

首先从采集的各种水蛭提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段COI基因片段，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立各种水蛭的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定宽体金线蛭的目的。对需要鉴定的水蛭样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物结果，然后测序，根据 序列比对可以鉴定出宽体金线蛭。本发明设计的用于鉴别宽体金线蛭的分子鉴定方法，采用如下步骤： 

1、提取水蛭总DNA按常规动物DNA提取方法或者血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1μg/μl-2μg/μl。 

2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为 

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′； 

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′； 

扩增程序为94℃预变性1分钟，45℃退火1.5分钟，72℃延伸1.5分钟，5个循环94℃变性1分钟，50℃退火1.5分钟，72℃延伸1分钟，35个循环72℃延伸5分钟。 

3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNA marker检测PCR片段大小。 

4、鉴定结果的判断：若出现明显清晰的709bp大小的条带，且无杂带，则可送生物公司测序。 

5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID NO.1同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为宽体金线蛭。 

其中，所述的水蛭DNA条形码分子鉴定方法采用的是血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。 

所述引物，正向引物为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′反向引物为5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。 

所使用的DNA聚合酶为pfu高保真酶。 

所述的电泳为1％-2％的琼脂糖凝胶电泳。 

所述的条带大小需要用DNA maker检测。 

所述的DNA序列拼接软件包括CodonCode Aligner、Sequencher、Genious、DNA star等软件。 

与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现宽体金线蛭的分子鉴定。 

附图说明