[发明专利]鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法。

背景技术

美国白蛾 Hyphantria cunea ( Drury)属鳞翅目灯蛾科，原产北美，广泛分布于美国北部，加拿大南部和墨西哥，后随交通工具传入欧洲、日本、朝鲜。1979年，在我国辽宁丹东首次发现美国白蛾，目前已蔓延至辽宁、陕西、河北、山东、天津、北京等省市。美国白蛾食性杂、食量大、繁殖力强、寄主范围极广，其寄主在美国、欧洲、日本、朝鲜超过600种，在我国的寄主植物已达49科108属175种，主要危害阔叶林木、果树、农作物，以幼虫取食树叶，造成严重的经济损失，是一种毁灭性害虫，也是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》规定的检疫性害虫。

在形态上美国白蛾与灯蛾科杨雪毒蛾、红缘污灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净白污灯蛾、星白雪灯蛾、稀点雪灯蛾、白雪灯蛾（如图1）等种类在成虫体色和形态上非常相似不易鉴别，幼虫、蛹、卵更难以区分。国家标准GB/T 23474-2009《美国白蛾检疫技术规程》中详细阐述了美国白蛾各个虫态的形态学鉴定方法，并列举了类似美国白蛾的7种灯蛾科和毒蛾科雄成虫外生殖器检索表。美国白蛾成虫、幼虫、蛹都能随果品及包装材料而传播扩散，口岸截获后，如果采用形态学鉴定方法，鉴定时间过长，结果不够准确。

发明内容

本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，采用该组合物可以快速准确地鉴定美国白蛾。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，由一个引物对和一个探针组成；所述引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明中，所述探针的5’末端标记有荧光报告基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团NFQ。 

本发明还提供所述组合物在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否为美国白蛾的试剂盒中的应用。

本发明还提供用于检测美国白蛾的试剂盒，包含所述引物对和探针。

本发明还提供所述组合物在检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾中的应用。

另外，本发明还提供检测或辅助检测待测样品是否为美国白蛾的方法，包括如下步骤：以待测样品中提取的总DNA为模板，采用所述组合物，或所述试剂盒进行实时荧光PCR检测，从而确定所述样品是否为美国白蛾。

在本发明中，所述引物对中的引物及探针的摩尔浓度之比为2:2:1。

在本发明中，所述PCR体系为：TaqMan mix混合反应液10μl，上游引物为0.5μl，下游引物为0.5μl，探针为0.25μl，DNA模板1μl，5 U/μl的Taq DNA聚合酶0.1 μl，加ddH₂O补足到20μl。

在本发明中，所述反应程序为：50℃ 2 min，95°C预变性10min；进入循环，95°C 15s，60°C 60s，共40个循环。

有益效果

通过对美国白蛾与其他形态相似蛾类的CO I基因进行比对发现，设计了鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物。本发明鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物，可以快速、准确、高效、可靠地对成虫、蛹、幼虫和卵进行鉴定，判别是否为美国白蛾。本发明方法的特异性强，可以将美国白蛾与其他形态近似的杨雪毒蛾、红缘污灯蛾、八点灰灯蛾、人纹污灯蛾、净雪灯蛾、净白污灯蛾、星白雪灯蛾、稀点雪灯蛾、白雪灯蛾区分开来。本发明方法灵敏度高，检出最低限可以达到0.25pg/μl总DNA。本发明鉴定或辅助鉴定美国白蛾的组合物及其检测方法对美国白蛾的口岸侦测、国内发生检测和控制，具有十分重要的意义与作用。

附图说明

图1虫样的形态图片。

图2 美国白蛾及其近似种样品PCR扩增产物的电泳图（部分样品），其中M为Marker；1-12分别为编号为HC01、HC04、YX01、YX02、HY01、HY02、BDH01、RWW01、JX05、JX06、XB01 、BX01的虫样的PCR扩增产物电泳图。

图3显示特异性引物探针位置示意图。