[发明专利]利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，

上引物VA-DPOF：如序列表Seq ID No.1所示，

下引物VA-DPOR：如序列表Seq ID No.2所示。

2.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物对，其特征在于， 

上引物VA-F：如序列表Seq ID No.3所示，

下引物VA-R：如序列表Seq ID No.4所示。

3.一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-collagenase的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：溶藻弧菌基因组DNA的提取和纯化；

（2）、选择溶藻弧菌collagenase基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上引物VA-F ，如序列表Seq ID No.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID No.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；

（3）、阳性对照品pMD-T-collagenase的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer 2.5μLdNTP (2.5mM for each)2.0μLVA-F(10μM)1.0μLVA-R(10μM) 1.0μLTaq DNA Polymerase(5U/μL)0.5μLDNA模板0.5μLddH₂O17.5μL

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 15s、57.6℃ 20s、72℃ 30s，35个循环；72℃延伸10min；

步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-collagenase作为阳性对照品。