[发明专利]利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。

背景技术

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌，分布于河口和海洋环境中，是引起鱼、虾、贝等多种海水养殖动物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起伤口感染、胃肠炎和败血症等症状，严重威胁着水产养殖业的发展，造成的经济损失巨大。此外该菌对人的致病性也有大量报道，可引起人食物中毒、耳炎、腹渴等，己经引起人们的重视。近年来，国内外报道溶藻弧菌引起急性腹湾和食物中毒病例日益增多。溶藻弧菌在自然界中广泛分布，尤其以海产品中携带率最高，是一种重要的引起细菌性食物中毒的致病菌。世界上各个国家食品卫生法规中均把该菌列入法定检测项目，一经发现禁止进口和出口。

目前，对溶藻弧菌的检测仍主要依靠传统方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统方法检测结果准确，但是存在检测效率低、检测目标单一、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。为满足致病菌快速检测的要求，发展了酶联荧光免疫检测法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶链式反应(PCR)、胶体金试纸条法、API生化鉴定试纸条法、环介导恒温扩增(LAMP)技术和实时荧光PCR等方法。其中，VIDAS-CHL法、EIA法、胶体金试纸法和API法均存在特异性差、灵敏度低等缺陷，而没有得到广泛应用；LAMP法，作为一种新兴的检测方法，尽管极大地提高了检测效率，又降低了检测成本，但是产生的假阳性率较高；PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等, 而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，以防止非特异性扩增，特别是涉及多重PCR时，需要大量的实验以验证检测方法的特异性，费时又费力。

Dual priming oligonucleotide (DPO) 引物设计方法，简化了建立常规PCR方法的操作步骤。该引物的设计分为两部分，中间用多聚次黄嘌呤肌苷连接，5'-端长18-25bp，3'-端长6-15bp。由于该类引物特殊的结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。同时，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。

在此情况下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法对致病性微生物实施精准检测，对保障公共卫生安全具有现实意义。本发明根据溶藻弧菌胶原酶collagenase靶基因的保守区设计合成了一对DPO引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了溶藻弧菌DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供利用DPO-PCR方法检测溶藻弧菌的DPO引物序列及检测试剂盒。

本发明的目的通过以下技术实现：

一种基于DPO引物精准检测溶藻弧菌的PCR方法检测用引物对，

上引物VA-DPOF：如序列表Seq ID No.1所示，

下引物VA-DPOR：如序列表Seq ID No.2所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物， 

上引物VA-F：如序列表Seq ID No.3所示，

下引物VA-R：如序列表Seq ID No.4所示。

2、一种基于DPO引物检测溶藻弧菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-collagenase的制备方法，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：溶藻弧菌基因组DNA的提取和纯化

（2）、选择溶藻弧菌collagenase基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上引物VA-F ，如序列表Seq ID No.3所示和下引物VA-R，如序列表Seq ID No.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；