[发明专利]一种基于微生物发酵和膜分离技术耦合生产埃博霉素B的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基于微生物发酵和膜分离技术耦合生产埃博霉素B的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilones)是粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一类次级代谢产物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G.H&ouml,fle等人于1993年首次报道。其相对分子质量为585。具有微管蛋白聚合和微管稳定的作用，对紫杉醇及其它抗癌药物有耐药性的癌细胞并有非常高的活性；具有较强的耐药性便于配制和使用，因此埃博霉素作为极具潜力的抗癌新药，引起了全世界的生物学家及药学家的研究热情。目前已有一个埃博霉素药物(BMS-247550，Ixabepilone，用于卵巢癌的治疗)投放市场，另外至少还有六个埃博霉素药物(ABJ-879，Patupilone,BMS-310705,KOS-862，KOS-1584和ZK-EPO)在进行临床研究。埃博霉素有望成为取代紫杉醇的更为有效的抗肿瘤药物。

目前主要依靠微生物发酵生产得到埃博霉素，在对发酵液分离埃博霉素之前，需要除去纤维堆囊菌发酵液中的菌体，菌体分离不仅是一步影响产品分离效果的关键操作，而且由于发酵液中的菌体中含有埃博霉素的降解酶，如不及时分离，将会对发酵液中的埃博霉素产生降解，影响产品收率。

微滤(MF)广泛使用于细胞、细菌和微粒子的分离，目标离子的范围为0.01μm～10μm。以静压差为推动力，利用膜的筛分作用进行分离，其作用相当于过滤。由于孔隙率占总体积的70％～80％，故阻力很小，过滤速度较快。

超滤(UF)是一种筛选分离过程，在静压差的推动力作用下，原料液中的溶剂和小溶质粒子从高压的料液侧透过膜到低压侧，一般称为淡液或透过液，而大粒子组分被膜所阻拦，使他们在滤剩液中的浓度增大。超滤主要用于从液相物质中分离大分子化合物(蛋白质、核酸聚合物、淀粉、天然胶、酶等)，从而达到某些含有高分子物质(蛋白质、酶、病毒)的溶液的浓缩、分离、提纯、净化。

与超滤及反渗透等分离过程一样，纳滤也是以压力差为推动力的分离过程，是一个不可逆过程。其分离机制可以运用电荷模型(空间电荷模型和固定电荷模型)、细孔模型以及近年来才提出的静电排斥和立体阻碍模型等来描述。与其它膜分离过程相比，纳滤膜的一个优点是能截留透过超滤膜的小分子量的有机物，又能透析反渗透膜所截留的部分无机盐，也就是能使“浓缩”与脱盐同步进行。

埃博霉素的生产和开发目前限于实验室水平和中试水平。实验室小规模制备的主要步骤包括：微生物发酵，大孔吸附树脂吸附，解析分离，干燥得到粗品，按这种方法，埃博霉素不断积累，发酵液浓度不断增大，溶氧的急剧下降，菌体死亡，导致埃博霉素合成酶的活性下降，发酵液中的埃博霉素的积累出现停滞甚至下降趋势，产量很难进一步提高。并且实验室生产制备过程中各个单元的操作都是相对独立的，生产时间延长，生产效率降低，成本增加。目前还没有将膜分离技术应用到埃博霉素的生产当中。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种基于微生物发酵和膜分离技术耦合生产埃博霉素B的方法，其产量高，并且操作简单，缩短了生产时间，降低了成本。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1)发酵培养：按1L接种10～100mg菌种比例，将纤维堆囊菌接种于发酵罐中进行发酵；

2)微滤膜过滤：发酵过程中当埃博霉素B的产量达到0.1mg/L时，则对发酵罐中的发酵液通过带有微滤膜的微滤装置进行过滤，被微滤膜截留的发酵液返回到发酵罐中，继续发酵，滤过液进入浓缩池；

3)超滤膜和纳滤膜过滤：当浓缩池内的液体体积累到发酵罐体积的50％～60％时，将浓缩池内的液体通过带有超滤膜的超滤仪和带有纳滤膜的纳滤仪进行过滤，经超滤膜的截留液返回到发酵罐中，滤过液继续经过纳滤膜进行过滤；经纳滤膜之后的截留液返回浓缩池，滤过液返回到发酵罐中；

4)埃博霉素B的浓缩粗提：将浓缩池中的液体进行浓缩、萃取，得到埃博霉素B。

所述的纤维堆囊菌为ATCC25532或ATCC25569。