[发明专利]构建体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及构建体及其应用。更具体地，本发明涉及构建体、制备转基因动物细胞的方法、转基因动物细胞或其培养物以及使非人动物线粒体功能缺失的方法。

背景技术

ρ0细胞是线粒体DNA完全缺失的细胞，真核细胞中，通过人工方法造成线粒体DNA完全缺失获得的细胞系称为ρ0细胞。ρ0细胞的建立有多种方法，经典的方法是用低剂量EB(溴化乙锭)长期处理。这种化学试剂能嵌入到DNA双链中通过干扰DNA聚合酶的作用影响线粒体DNA的复制造成了线粒体DNA的缺失。虽然EB更倾向于插入到线粒体双链DNA中，但是不能排除它对核基因组产生的轻微影响，因此EB在诱导ρ0细胞过程中可能会造成核基因的诱变效应。这种方法经典但并不是万能的，不是所有的细胞系都能EB处理获得ρ0状态。有些细胞系对EB有抗性，例如Hep3B细胞通过该方法就不能达到ρ0状态。此外，EB是一种高致癌诱变剂，所以这种方法常被研究人员摒弃。除了EB以外，其他的化学试剂如双脱氧胞苷(Nelson,I.,et al.,1997)、地特氯胺等也被用来尝试通过干扰mtDNA的复制建立ρ0细胞系，但是所有的化学试剂都有他们的缺陷如造成基因突变及多种耐药基因的表达。为此，研究人员不断寻找更有效的方法诱导线粒体DNA缺失获得ρ0细胞。

目前使用较多的是与酶相关的方法清除线粒体DNA，这种方法不仅缩短了诱导时间还提高了诱导效率，比药物诱导更特异更安全。DNA聚合酶γ是线粒体DNA复制多种复合物之一。通过稳定表达显性负向线粒体特异的DNA聚合酶γ可以干扰线粒体DNA复制达到清除线粒体DNA的目的。此外，人和鼠的mtDNA上都有多个ECOR1酶切位点，人的线粒体DNA由于种族差异存在3-5个EcoR1酶切位点，小鼠有三个EcoR1酶切位点，大鼠有七个EcoR1酶切位点。Kukat等人根据这个特点找到一种温和、可靠、省时的方法有效清除了线粒体DNA，即通过限制性内切酶EcoR1与线粒体定位的序列结合连接到表达载体上，然后转染细胞经过筛选获得了线粒体DNA缺失的细胞。但是目前用于切割线粒体DNA的方法效率较低。

因而，现阶段，找到一种酶学上的能够高效切割线粒体DNA，制备ρ0细胞的方法，意义重大。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够高效剪切宿主细胞线粒体DNA、从而制备获得ρ0细胞的构建体。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

发明人发现人类单纯疱疹病毒UL12基因的有效变体UL12.5，能够编码核酸酶，精确特异地定位于线粒体造成线粒体DNA缺失，并且其对线粒体DNA的剪切效率非常高，能在短时间内达到清除线粒体DNA的效果，而这种特异的核酸酶的方法也轻松解决了药物诱导线粒体功能缺失所产生的负面效应。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，将该构建体转染动物细胞，能够有效实现对动物细胞尤其是哺乳动物细胞线粒体基因的切割，使该细胞的线粒体丧失功能，获得无线粒体功能的ρ0细胞株，且切割效率高、安全高效、重复性好。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使用前面所述的构建体转化宿主细胞；以及分离转基因动物细胞。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效地实现对动物细胞尤其是哺乳动物细胞的线粒体基因的剪切修饰，获得无线粒体功能的ρ0细胞，并且，切割效率高、安全高效、重复性好。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞或其培养物，其中所述转基因动物细胞是通过前面所述制备转基因动物细胞的方法获得的。根据本发明的实施例，本发明的转基因动物细胞为无线粒体功能的ρ0细胞，其因特异位点被剪切而发生突变，从而能够有效作为线粒体疾病模型应用于人类线粒体疾病发病机理以及预防和治疗的研究。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种使非人动物线粒体功能缺失的方法。根据本发明的实施例，该方法为：使用前面所述的构建体转化所述非人动物。发明人发现，利用该方法能够有效地获得线粒体功能缺失的转基因动物，从而该转基因动物能够有效用作人类线粒体疾病发病机理以及预防和治疗研究的动物模型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。