[发明专利]核酸检测方法

权利要求书

1.一种核酸检测方法，其特征在于包括以下步骤：

①确定待测目标序列及其待测靶序列；

②根据目标序列设计合成锁式探针；

③制备滚环扩增引物；

④制备交联探针；

⑤进行连接反应，将待测目标序列与锁式探针，缓冲液组成的混合液被加热到85～95℃后冷却到室温，然后加入连接酶，与连接酶混合后在20～37℃孵育0.5～4小时，加热使连接酶变性失活；

⑥以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；

⑦滚环扩增完成后，用交联探针检测滚环扩增产物，检测时，在未加入核酸酶孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶孵育后记录荧光值作为终点值，若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。

2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤②锁式探针的设计方法是5’末端被磷酸化的探针在这端有一段10～15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10～15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度18～25个碱基；而5’端和3’端中间靠近3’端区域，是“信号产生”区域，长度22～24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。

3.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤③制备的滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补。

4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤④的交联探针包括探针A和探针B；

探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8～12个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的8～12个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段与探针B对应区域有限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位；探针A的5’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶的识别位点，且其3'末端标记有淬灭基团，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧；

探针B由三部分组成，其3’端一段12～15个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12～15个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分。

5.一种核酸检测方法，其特征在于包括以下步骤：

①确定待测目标序列及其待测靶序列；

②根据目标序列设计合成锁式探针；

③制备滚环扩增引物；

④制备交联探针；

⑤将含有锁式探针、滚环扩增引物、交联探针A、交联探针 B、缓冲液、连接酶、聚合酶、核酸酶与待测片段的混合液在20℃～37 ℃孵育4～21小时后监测荧光信号值，在未加入核酸酶孵育之前记录荧光值作为初始值，加入核酸酶孵育后记录荧光值作为终点值，若终点值与初始值前后差值大于阴性对照品的3倍或3倍以上，说明含有目标靶序列。

6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤⑤中所述的缓冲液提供连接酶、聚合酶和核酸酶同时发挥活性的环境；连接酶连接DNA链3’端羟基和5’磷酸基团为磷酸二酯键，聚合酶以环状DNA为模板延伸引物，复制核酸序列，核酸酶为识别位点是特定序列双链DNA的内切酶。

7.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤②锁式探针的设计方法是5’末端被磷酸化的探针在这端有一段10～15个碱基区域与靶序列3’端的15个碱基互补，而探针3’端也有一段10～15个碱基区域与靶序列5’端碱基互补，探针与靶序列杂交后，探针3’端与5’端呈相邻的状态，这两段被统称为“模板杂交”区域；在5’端和3’端中间靠近5’端区域，是滚环扩增的引物杂交的“引物杂交”区域，长度18～25个碱基；而5’端和3’端中间靠近3’端区域，是“信号产生”区域，长度22～24个碱基；每个区域之间用5个连续T碱基分隔开。

8.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤③制备的滚环扩增引物与锁式探针靠近5’端的“引物杂交”区域互补。

9.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于：步骤④的交联探针包括探针A和探针B；

探针A由两部分组成，第一部分从5’端起始，5’端一段8～12个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域的5’端的8～12个碱基序列相同，第二部分是3’端若干个碱基长的一段与探针B对应区域有限互补，且这个区域配对杂交后包含限制性内切酶的识别部位；探针A的5’端起始位置的T上标记了一个荧光基团，紧接着两个T碱基之后，是限制性内切酶的识别位点，且其3'末端标记有淬灭基团，这样淬灭基团与荧光基团被限制性内切酶识别部位的分隔在两侧；

探针B由三部分组成，其3’端一段12～15个碱基的区域与锁式探针“信号产生”区域3’端12～15个碱基序列相同，接下来的第二部分是与探针A形成有限互补的区域，而5’端的第三部分是一段不与探针A杂交的悬垂部分。