[发明专利]核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸分析检测方法，具体涉及一种可在恒温条件下利用多种酶检测核酸序列的方法。

背景技术

核酸序列检测在现代生物学和医学中占有的极其重要的地位，这一领域自上世纪90年代以来呈几何级数快速增长，并且极可能在以后的几十年里持续发展。例如，在病人的组织样本中检测致病细菌或病毒，以及在特定癌变相关基因序列，对疾病的诊断、治疗和康复提供信息和决策依据。

有研究表明，单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)和短基因片段的插入/缺失与癌症的发病及药物代谢相关。另有研究表明，某些RNA在肿瘤发展的过程中起到关键作用。人类微小RNA(microRNA, miRNA)基因通常位于癌症相关的基因附近，某些miRNA在癌症病人样本中的表达比在正常组织中要少。比如，miRNA的异常表达可见于慢性淋巴细胞白血病、大肠癌、伯基特淋巴瘤、肺癌、大细胞淋巴瘤、恶性胶质瘤和B细胞淋巴瘤等癌变组织细胞中。因此，为了理解miRNA的表达模式，研究人员需要分析miRNA的有力工具。而对未纯化、未富集的细胞、生物液体甚至活组织中的核酸序列进行检测的实验需求对检测技术的发展不断提出新的挑战，但这些需求也促进了DNA/RNA检测技术的不断发展。

聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)可用于将少数拷贝的靶基因在较短时间内指数扩增到可以检测的浓度，但由于在PCR循环中需要加热以熔化DNA双链，这就使得PCR不适用于那些需要在活细胞中进行核酸检测的场合。即使是体外核酸检测应用，对热循环仪和熟练掌握PCR的技术人员的需求可能会使得资源贫乏的基层单位对核酸检测望而却步。

所以通过非PCR或者非连接酶链反应(ligase chain reaction, LCR)进行核酸检测成为近十年来热门的研究领域。恒温核酸扩增检测技术，尤其是那些可以在细胞存活温度(30℃～37℃)下运行的技术手段，有助于了解活细胞中基因的瞬时表达。

滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是20 世纪90年代报道的一种恒温核酸扩增检测技术。在该技术中，DNA聚合酶利用环形模板，扩增出含大量重复片段的长链核酸产物。RCA与锁式探针(padlock probe)耦合可以用来实现目标核酸序列的检测。锁式探针是一段较长的单链核苷酸序列，在3’和5’端分别有一段与靶标核酸序列互补配对，与目标核酸杂交后连接酶(ligase)可以将探针磷酸化的5’端与3’端连接，从而环化锁式探针，为RCA提供环形模板。之后DNA聚合酶在有引物存在的情况下即可开始扩增，扩增的产物可以通过各式各样的方法被检测。滚环扩增是恒温扩增DNA或RNA靶序列的有效手段，但扩增是线性的，其敏感性还有待进一步提高。

关于滚环扩增检测核酸的方法，中国专利文献CN 102827929 A（申请号 201210271932.0）公开了一种核酸检测方法，先根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物，将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活；以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；滚环扩增完成后，以滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。上述核酸检测方法步骤较为繁琐，需要在操作中加热反应体系，而且对磁珠富集的产物进行肉眼观察，检测结果受主观影响较大，重复性难以保证。

最近，利用核酸酶(切口酶、限制性内切酶或外切酶)进行DNA或者RNA恒温检测的方法日益增多，涌现出一大批对核酸特异性检测的新技术。交联探针(junction probe, JP)是一个新型恒温检测平台，它主要利用的是限制性内切酶(restriction endonuleases, REAses)和有限互补的一对探针。在不存在检测模板的情况下，因为这对探针互补碱基对数目少，相互间的亲和力较弱，在溶液中主要以单链形式存在。但在检测目标存在时，这一对探针可以与其杂交结合形成“Y”型结构，此时限制性内切酶可以对该结构进行切割，然后荧光信号被释放。JP技术成本较低，操作简便，检测时间短，但是，检测一个序列就要准备一对根据该序列设计的修饰探针，给利用其技术平台大规模开发多品种检测试剂带来了障碍。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可在恒温条件下利用多种酶检测核酸序列的方法。

实现本发明目的的第一种技术方案是一种核酸检测方法，包括以下步骤：