[发明专利]光控四唑-烯点击化学合成多肽水凝胶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽水凝胶的制备方法，尤其涉及一种光控“四唑-烯”点击化学合成多肽水凝胶的制备方法。 

背景技术

水凝胶是一种以水为分散介质的凝胶，具有三维网络立体结构，具有对环境刺激的敏感性、高溶胀性、渗透性及与人体组织的相似性，负载能力较高，可以实现对药物的高效包载；这些特性使得水凝胶在组织工程、药物运载和靶向治疗中得到了广泛的应用。目前，用于制备水凝胶的方法主要为物理交联法和化学交联法，其中。物理交联包括憎水作用、聚乳酸的立体复合作用、静电作用等，化学交联方法形成水凝胶的典型反应有：酶交联反应、自由基聚合反应、希夫碱反应、双硫键反应、迈克尔加成反应等。 

多肽是一种天然的生物大分子。基于多肽的水凝胶完全降解后的产物只有氨基酸，因此在人体内不会产生不良影响，也不会引起机体的不良反应以及一些组织炎症，使得多肽在开发创新医药学技术方面发挥越来越重要的作用，如药物的控释技术、细胞治疗新支架的研究、组织工程等。而且，多肽水凝胶具有良好的生物相容性，它能为细胞的分布和细胞外基质的积累提供支架，并且这些具有生物适应性和生物降解性的支架，在组织修复和组织工程中有着十分广泛的应用。目前，多肽水凝胶的制备方法主要有自组装法和化学交联法，其中，自组装法多用于注射性的多肽水凝胶，授权公告号为CN102408575B的中国发明专利公开了通过超声震荡法助溶，将离子补偿性多肽溶于浓度为3～20mM的NaCl水溶液中，再由所得溶液通过自组装得到可注射多肽水凝胶；化学交联法包括酶催化交联法和点击化学法，其中授权公告号为CN102688525B的中国发明专利公开了一种酶催化交联法制备的多肽水凝胶，Macromolecules，2012,45,9579-9584中描述了一种点击化学法制备的多肽水凝胶。上述制备多肽水凝胶的方法存在一定的不足之处：(1)多肽的自组装水凝胶之间都是通过较弱的分子间非共价作用结合，这使得水凝胶的机械性能较差，很容易被破坏；(2)酶催化交联可能会会引发毒性和免疫反应；(3)传统的点击化学合成多肽水凝胶过程中加入了铜催化剂，其存在可能会诱导病毒或寡核苷酸的降解，并且具有细胞毒性；而无铜点击化学的方法制得的多肽水凝胶通常受限于凝胶时间较长且储存模量较低。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种光控“四唑-烯”点击化学合成多肽水凝胶的制备 方法，该方法中水凝胶在制备的过程中具有时空可控性，既保留了传统的“点击化学”快速高效、专一性和反应条件温和的特点，又无须光引发剂和铜盐等催化剂，且得到的多肽水凝胶具有荧光性，便于观察，适用于药物载体、生物医学以及药物释放等领域。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种光控“四唑-烯”点击化学合成多肽水凝胶的制备方法，包括以下步骤：多肽四唑衍生物的合成： 

(1)在氮气的保护下，向50mL两颈瓶中加入0.2～0.4g四唑，二氯甲烷15～20ml搅拌至溶解，得到四唑的二氯甲烷溶液； 

(2)向四唑的二氯甲烷溶液中加入DCC(N,N-二环己基碳二亚胺)150～200mg继续搅拌15～20min，得到四唑溶液； 

(3)将多肽溶于5～10mL二氯甲烷中，得多肽溶液，其中，多肽的氨基酸序列为ThrSerThrSerThrSerThrSerThrSerThrSer，如SEQ ID NO.1所示，且每个氨基酸中均含有一个侧链羟基，将上述多肽溶液加入到步骤(2)所得的四唑溶液中，搅拌15～20min；向多肽与四唑的混合液中加入10～15mg DMAP(4-二甲氨基吡啶)，反应10～12h，过滤，滤液用冰乙醚沉淀，干燥后得到多肽分子的四唑衍生物； 

多肽水凝胶的光控点击合成： 

(4)分别将步骤(3)所得多肽四唑衍生物和端基修饰烯丙基的双链DNA溶于Tris-HCl缓冲液中，至完全溶解，其中多肽与DNA的摩尔比为1:2～1:4； 

(5)将步骤(4)所得混合液在37℃下混合均匀后，于真空条件下，置于波长300～400nm的紫外灯下，光照100～200s，引发“四唑-烯”点击化学反应，迅速交联形成具有荧光性能的多肽水凝胶。 

优选地，步骤(3)所述选多肽与四唑的摩尔比为1:6。 

所述双链DNA中的一条为核酸适体链。 

所述核酸适体链为AS1411适体或sgc8适体。 

优选地，步骤(4)所述多肽与DNA的摩尔比为1:3。 

步骤(4)所述Tris-HCl缓冲液的pH7.4，含10mM NaCl。