[发明专利]蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法

权利要求书

1.蚊媒病毒常温收集和保存、及检测方法，包括以下步骤：

（1）在疑似蚊媒致病病毒区域，捕捉30~200只同一种类或不同种类的蚊虫逐一地放入青霉素小瓶中，过夜，饥饿后，待进入步骤 （2）；

（2）按以下两种方法之一收集病毒：

 (a) 室温24~27℃下，把定性滤纸剪成3cm²若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加 RNA保存液的位置，取若干个干净培养皿加10% 蔗糖水，把医用棉球浸泡在培养皿中，将滤纸放在棉球上，再在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，按每份滤纸20~70只蚊虫将步骤1）存活的蚊虫驱入放有培养皿的15~30cm³纱笼内，让蚊虫取食，每天换一次滤纸，共5~7天；

    或者，(b) 把步骤1）收集于青霉素小管中的蚊虫-85℃ 冻存，按 48小时间隔分批用空斑试验检测蚊虫的感染病毒滴度，收集病毒液；之后，把定性滤纸剪成3cm²若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加 RNA保存液和病毒液的位置，取若干个干净培养皿，放置医用棉球，将滤纸放在棉球上，在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，再取病毒液于同一位置滴加0.25ml；

（3）病毒保存

将步骤2）(a)蚊虫取食过的滤纸或步骤2）(b)滴加了蚊虫病毒液的滤纸作为病毒载体在室温24~27℃下分别放置，并在7天内进行检测；

（4）对被蚊虫取食过的载体提取病毒RNA

用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒规定方式提取病毒RNA；

（5）PCR扩增及检测

 设计PCR反应体系的病毒菌的5’，3’端保守序列引物及该引物的PCR反应条件；以PCR反应产物凝胶成像及测序鉴定。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征是步骤 1）进一步是把捕捉的蚊虫置于青霉素瓶中过夜，使其饥饿；翌日，将存活的蚊虫驱入步骤 2）纱笼内，纱笼内温度24~27℃，昼夜温差<2℃，相对湿度70%~80%，光照时间12~14h，使其存活。

3.如权利要求 1或 2所述的方法在乙脑病毒收集、保存及检测中的应用，其特征是所述步骤2）之(b) 当感染的乙脑病毒液的病毒滴度为7. 85 log PFU / ml时，收集病毒液。

4.根据权利要求 3 所述的应用，其特征是所述步骤 4）PCR扩增PCR反应体系（单位：微升）为：MgCl₂ 5微升，Buffer 2.5微升，dNTP 2.5微升，P1             0.5微升，P2  0.5微升，P3 0.5微升，R  1微升，F  1微升，模板RNA 4微升，     H₂O  7.5微升；该PCR反应体系以JE-251F和JE-925R为基因扩增引物，其中：

     F: CGT  TCT  TCA  AGT  TTA CAg CAT TAG  C；

     R: CCY  RTG  TTY CTG CCA AGC ATC CAM  CC；

    PCR反应条件: ①50℃ 30分钟；②94℃ 5分钟；③95℃解链30秒；③52℃退火 1分钟；④72℃延伸60秒；⑤ ③~④45个循环；⑥72℃延伸15分钟；鉴定基因扩增片段为乙脑病毒条带700bp。