[发明专利]蚊媒病毒常温收集、保存和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒的收集、保存及检测，特别是蚊媒病毒收集、保存及检测。

背景技术

媒介蚊虫携带的病原微生物中，病毒是引起严重疾病的主要的致病因而广受关注，如乙脑病毒、登革热病毒等。蚊虫监测只是蚊媒病监测的一个方面，要准确预测蚊媒病流行风险，其中重要的是掌握媒介蚊虫携带病原微生物的种类和数量。目前对蚊媒病毒监测的主要手段是对媒介蚊虫体内的病毒进行检测，该方法需要大量搜集蚊虫，并要求有冷链技术来保存蚊虫体内病毒的完整性，以带回实验室进行病毒提取分离、血清学及免疫学实验等，或者进行病毒 RNA分析[Ritchie SA, et al., 2007]。在野外运输和携带上，冷链技术采用的液氮罐重量大，具有危险且使用不方便；在检测分析上，由于病毒 RNA分析容易受蚊虫自身 RNA干扰，病毒分离效率低，血清学和免疫学检测灵敏度不高；同时，搜集大量蚊虫进行病毒分析是一项费力、费钱的工作，因而，需要有新的技术来替代目前的蚊媒病毒监测技术。

发明内容

本发明利用蚊虫取食过程中唾液反吐同时排出病毒的生物学特性，收集病毒，并将病毒 RNA 在常温下保存于载体7天以上，完成实验室检测，以提高病毒分离效率，节省人力和物力。

本发明的方法通过以下方式实现，其步骤为：

（1）在疑似蚊媒致病病毒区域，捕捉30~200只同一种类或不同种类的蚊虫并逐一地放入青霉素小瓶中，过夜，饥饿后，待进入步骤 （2）；

（2）按以下两种方法之一收集病毒：

 (a) 室温24~27℃下，把定性滤纸剪成3cm²若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加 RNA保存液的位置，取若干个干净培养皿加10% 蔗糖水，把医用棉球浸泡在培养皿中，将滤纸放在棉球上，再在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，按每份滤纸30~70只蚊虫将步骤1）存活的蚊虫驱入放有培养皿的15~30cm³纱笼内，让蚊虫取食，每天换一次滤纸，共5~7天；

       或者，(b) 把步骤1）蚊虫按 48小时间隔分批收集于青霉素小管中，-85℃ 冻存，用空斑试验检测蚊虫的感染病毒滴度，收集病毒液；之后，把定性滤纸剪成3cm²若干份作为收集病毒的载体，每份滤纸中央标记滴加 RNA保存液和病毒液的位置，取若干个干净培养皿，放置医用棉球，将滤纸放在棉球上，在滤纸标记位置滴加0.25ml RNA保存液，再取病毒液于同一位置滴加0.25ml；

（3）病毒保存

 将步骤2）(a)蚊虫取食过的滤纸或步骤2）(b)滴加了蚊虫病毒液的滤纸作为病毒载体在室温24~27℃下分别放置，并在7天内进行检测；

（4）对被蚊虫取食过的载体提取病毒RNA

用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒规定方式提取病毒RNA；

（5）PCR扩增及检测

     设计PCR反应体系的病毒菌的5’，3’端保守序列引物及该引物的PCR反应条件；以PCR反应产物凝胶成像及测序鉴定。

    所述的方法的步骤 1）进一步是捕捉的蚊虫置于青霉素瓶中过夜，使其饥饿；翌日，将存活的蚊虫驱入纱笼内，供 8% 蔗糖水，纱笼内温度24~27℃，昼夜温差<2℃，相对湿度70%~80%，光照时间12~14h，使其存活。

作为上述方法一种应用是乙脑病毒收集、保存及检测：     步骤2）之(b) 当感染的乙脑病毒液的病毒滴度为7. 85 log PFU / ml时，收集病毒液。

所述的应用，其特征是所述步骤 4）PCR扩增PCR反应体系（单位：微升）为：MgCl₂ 5微升，Buffer 2.5微升，dNTP 2.5微升，P1  0.5微升，P2  0.5微升，P3 0.5微升，R  1微升，F  1微升，模板RNA 4微升，H₂O  7.5微升；该PCR反应体系以JE-251F和JE-925R为基因扩增引物，其中：

     F: CGT  TCT  TCA  AGT  TTA CAg CAT TAG  C；

     R: CCY  RTG  TTY CTG CCA AGC ATC CAM  CC；

    PCR反应条件: ①50℃ 30分钟；②94℃ 5分钟；③95℃解链30秒；③52℃退火 1分钟；④72℃延伸60秒；⑤ ③~④45个循环；⑥72℃延伸15分钟；鉴定基因扩增片段为乙脑病毒条带700bp。