[发明专利]重组依赖的核酸滚环扩增方法在审
申请号: | 201410168939.9 | 申请日: | 2014-04-25 |
公开(公告)号: | CN103966197A | 公开(公告)日: | 2014-08-06 |
发明(设计)人: | 俞国华 | 申请(专利权)人: | 俞国华 |
主分类号: | C12N15/10 | 分类号: | C12N15/10 |
代理公司: | 暂无信息 | 代理人: | 暂无信息 |
地址: | 200062 上海市普*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 重组 依赖 核酸 扩增 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种新型的核酸滚环扩增方法,即重组依赖的核酸滚环扩增方法(Recombination-Dependent Rolling Circle Amplification,RD-RCA)。
具体来说,重组依赖的核酸滚环扩增方法(RD-RCA)又可以分成两种,分别是:拓扑异构酶介导环化的核酸滚环扩增方法(Topoisomerase-mediated Rolling Circle Amplification,Top-RCA)和位点特异性重组酶介导环化的核酸滚环扩增方法(Site-Specific Recombinase mediated Rolling Circle Amplification,SSR-RCA)。这是因为Top-RCA和SSR-RCA在核酸环化的过程中,都需要进行DNA的切割和重新连接,即都需要进行DNA的重组,所以将Top-RCA和SSR-RCA统称为重组依赖的核酸滚环扩增方法(RD-RCA)。
背景技术
核酸的大量扩增对于现代分子生物学具有重要的意义。目前使用最多核酸扩增技术是1985年发明的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),即所谓的PCR技术【Science,230,1350 – 1354,1985】。PCR通过指数扩增方式可以达到高灵敏检测核酸的目的。另外,由于PCR扩增产物可以回收,使该技术在分子克隆中具有广阔的用途。虽然PCR技术是现代分子生物学技术的核心之一,但是其也有明显的缺点:(1)由于PCR整个过程分成变性、退火和延伸三个步骤,而且三个步骤反复循环,整个过程必须要有精确控制温度的热循环仪;(2)由于PCR扩增过程只使用2个引物,经常会出现非特异性扩增等问题。
为了克服PCR的上述缺点,后来又开发了许多新的核酸扩增技术:比如整个扩增过程只需使用一个温度的各种等温核酸扩增技术。由于整个扩增过程只需一个温度,这样就无需使用精确控制温度的热循环仪,只需一个水浴锅即可完成。甚至,有些方法由于可以在室温进行扩增,这样甚至连水浴锅都不需要,就可以完成核酸的大量扩增。此外,其中有些等温扩增方法由于使用了多个引物或者通过连接酶共价连接等技术,使得扩增的特异性大大提高。
目前,主要的核酸扩增技术主要如下几种。
LCR(Ligase Chain Reaction, 连接酶链式反应)【Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1991,88,189-193】。LCR使用两个靠近的寡核苷酸探针与同一DNA链杂交,而后通过连接酶将二者共价链接。由于只要一个核苷酸不同,两个寡核苷酸探针就无法共价链接,该方法与PCR相比,其特异性非常高。但是该方法与PCR类似,需要在变性(如94℃)和链接(如65℃)两个温度之间反复循环,仍然需要使用精确控温的热循环仪。
SDA(Strand Displacement Amplification, 链置换扩增)【Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1992, 89,392-396】。SDA通过在引物中引入限制性内切酶识别位点,以及使用dNTP类似物的情况下,在双链DNA的一条链上产生缺口(nick),缺口产生的3’-OH可以作为引物,在DNA聚合酶的作用下开始延伸,而将下游的旧链作为单链置换出来。因链延伸而合成的新链又可以在限制性内切酶的作用下产生新的缺口,如此反复,就可以指数扩增目的核酸。该方法一个重要的缺点是:在加入各种酶之前,必须对模板进行热变性,使得整个扩增过程仍然需要两个温度,非真正意义的等温基因扩增。
NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, 核酸序列依赖的扩增)或TMA(Transcription Mediated Amplification, 转录介导的扩增)【Nature,1991,350,91-92】。NASBA在逆转录酶、RNase H、DNA聚合酶、T7 RNA 聚合酶的帮助下,通过一系列的反转录和转录的往复循环,达到扩增核酸的目的。由于该方法必须在同一个系统中使用多种酶,反应的体系和条件较难控制,成本也较高。而且,NASBA只能用于扩增单链RNA。
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