[发明专利]抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种新的多抗原广谱CTL的制备方法和应用。 

背景技术

目前，癌症的抗肿瘤免疫治疗策略主要有：肿瘤全细胞疫苗(Whole-tumor cell vaccines)、树突状细胞疫苗(Dendritic cell vaccines,DC疫苗)、重组蛋白疫苗(recombinant proteins vaccines)、多肽疫苗(Peptide vaccines)、DNA疫苗(DNA vaccines)和病毒疫苗(Viral vaccines)等，有研究显示，以DC疫苗联合过继性T细胞免疫治疗(adoptive T-cell therapy)效果最好。DC是目前发现的功能最强大的专职抗原递呈细胞，成熟DC表面高表达MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)和黏附分子(LFA-3、ICAM-1等)，不仅能有效的将肿瘤抗原递呈给已活化或记忆性T细胞，还能将抗原递呈给初始T细胞使其增殖，是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在适应性T细胞免疫应答的诱导中具有独特的地位。目前，以DC为基础的CTL主要包括：肿瘤抗原肽致敏的CTL、肿瘤全细胞抗原致敏的CTL、肿瘤抗原基因转导的CTL等。其中，用肿瘤抗原肽或肿瘤全细胞抗原致敏DC回输后，虽然可以引起特异免疫保护作用，但并不持久；然而有意义的是，从有限的肿瘤组织中扩增足量的有效刺激DC的mRNA，采用差异筛选方法获特异性表达的肿瘤特异性抗原mRNA导入DC，制备RNA疫苗，或将肿瘤抗原基因以裸DNA方式导人DC，或以病毒为载体转导DC，使DC持续表达肿瘤抗原，可解决上述两种CTL因抗原解离、肿瘤来源有限、有诱发自身免疫性疾病危险等不足的问题。 

目前基因修饰DC的方法主要有病毒载体和非病毒载体介导两大类方法。非病毒载体介导的方法主要有脂质转导、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法等。脂质体转导作为早期的方法之一近年来虽然不断改进，但其转导效率不高和细胞毒性 仍是其广泛应用的障碍，同时对DC的功能及活性也有较大的影响。现认为病毒载体对DC的转导更为有效。如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。腺病毒载体转基因效率高，不受靶细胞是否为分裂细胞的限制，容易制得高滴度病毒载体，生物活性评价也较简便，但由于有较高的免疫原性，导致其使用受限。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的广谱肿瘤抗原特异性的CTL，使用慢病毒载体细胞基因工程的方法，利用树突状细胞强大的抗原递呈功能，更有效的激活广谱肿瘤抗原特异性T淋巴细胞的增殖和杀伤能力。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种CTL的制备方法，包括步骤： 

A)携带肿瘤抗原基因重组载体的构建； 

B)DC细胞的分离与培养； 

C)使用步骤A)所述重组载体转导步骤B)所述的未成熟DC细胞； 

D)进一步通过细胞因子诱导步骤C)所述的未成熟DC细胞成为成熟DC细胞； 

E)将步骤D)所述的成熟DC细胞与T淋巴细胞共培养，获得具有抗原特异性的杀伤毒T淋巴细胞，即CTL。 

所述的肿瘤抗原基因为新构建的癌胚抗原(CEA)基因片段，或黑色素瘤相关抗原A3(MAGE-A3)基因片段，或粘蛋白1抗原(MUC1)基因片段；本发明通过大量的筛选和探索，最终确定出癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；黑色素瘤相关抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；粘蛋白1抗原基因片段如SEQ ID NO:3所示，使得最终制备得来的CTL具有极佳的抗原特异性。 

在采用血细胞分离仪或直接抽取肿瘤患者静脉外周血(50-150毫升)，分离出外周血单个核细胞(PBMC)。经培养，PBMC被分离为淋巴细胞和单核细胞，淋巴细胞继续培养，备用。携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的慢病毒载体感 染未成熟的单核细胞来源的未成熟DC细胞，并以细胞因子TNF-α诱导成熟的树突状细胞(DC)产生。将成熟的DC与T淋巴细胞混合培养，使淋巴细胞诱导成为具有抗原特异性的，杀伤抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，最后将被激活的CTL回输给肿瘤患者。整个过程需要12-14天。 

本发明优选为同时转导可用于表达CEA、MAGE-A3、MUC1三种广谱肿瘤抗原的慢病毒混合载体转导未成熟DC细胞，获得经活化和增殖的肿瘤抗原特异性的T细胞(Lv-DC-CTL)，以达到更大的广谱肿瘤治疗范围和针对多靶点抗原诱导，增强特异肿瘤杀伤性的治疗效果。