[发明专利]一种诱导DC细胞成熟的苦荞提取物、培养基及诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物提取物领域，特别涉及免疫调节相关的DC细胞诱导领域 

背景技术

树突状细胞(Dendritic cells，DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8⁺T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。 

《本草纲目》记载：苦荞麦味苦，性平寒，益气力，续精神，利耳目，有降气宽肠健胃的作用。现代临床医学观察表明，苦荞麦粉及其制品具有降血糖、降血脂，增强人体免疫力的作用，对糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、中风等病人都有辅助治疗作用。从苦荞中提纯活性物质，以便使其作用最大化，成为近来研究方向。 

发明内容

本发明涉及一种本发明意外发现的能够诱导DC成熟的苦荞提取物及其提取方法，和利用该苦荞提取物制备的其诱导DC成熟的专用培养基、诱导方法，以及一种利用其制备的免疫增强剂。 

具体而言，本发明涉及以苦荞麦(拉丁名Fagopyrum tataricum，蓼科，荞麦属)特别是山西苦荞黑风一号种子(山西省农科院种子资源所提供)为原料， 提取、分离、纯化得到的一种具有凝集素活性的苦荞蛋白质类制品及其诱导DC成熟的专用培养基制备方法。 

在一个实施方式中，本发明提供了一种苦荞提取物的提取方法，包括：提取苦荞种子所含蛋白质；Resource Q阴离子交换层析；和Sephadex G75凝胶过滤层析，获得包含分子量约60～65kD的蛋白质的层析馏分，所述层析馏分为所述苦荞提取物。 

在一个优选的实施方式中，其中所述苦荞种子为山西苦荞黑风一号的种子。 

在一个实施方式中，其中所述提取苦荞种子所含蛋白质的步骤包括：将烘干的所述苦荞种子脱壳粉碎；将粉碎后的所述苦荞种子用醋酸盐缓冲液在4℃下抽提；离心除去沉淀；将离心后的上清液用硫酸铵沉淀，优选使得硫酸铵的饱和度达到80％；和将得到的沉淀用缓冲液溶解后透析，得到所述苦荞种子所含蛋白质。 

本发明还提供了一种由上述方法获得的苦荞提取物，所述植物凝集素包含如上所述的苦荞提取物。所述苦荞提取物优选具有凝集素活性。优选地，所述凝集素为所述分子量约60～65kD的蛋白质。 

本发明还提供了一种诱导树突状细胞成熟的培养基，包含上述苦荞提取物或植物凝集素。 

该培养基可进一步包含RPMI-1640培养基、rhIL-4、rhGM-CSF和胎牛血清。 

在一个优选实施方式中，其中在所述培养基中所述苦荞提取物中分子量为60～65kD的蛋白质的终浓度为45～55μg/mL，优选50μg/mL。 

本发明还提供了一种诱导树突状细胞成熟的方法，所述方法包括用上述诱导树突状细胞成熟的培养基诱导培养2～3天，优选2天。 

在用所述诱导树突状细胞成熟的培养基培养之前，进一步包括： 

在含10％FCS的RPMI-1640培养基中加入含DC的外周血单个核细胞和诱导因子rhIL-4和rhGM-CSF，培养到第7～8天，优选第7天时使用所述诱导树 突状细胞成熟的培养基。 

本发明建立了成熟、稳定的诱导DC成熟的培养体系，所需的细胞因子少，且DC成熟度高，表面标志物提升明显。本发明为进一步开发树突状细胞疫苗提供了新型有效的途径。 

本发明还提供了一种DC疫苗增强剂，包括上述苦荞提取物或植物凝集素，优选进一步包括rhIL-4和rhGM-CSF。本发明的苦荞提取物通过诱导DC细胞成熟并促进成熟DC细胞增殖，不仅仅能够由于科学研究中作为诱导试剂使用，还能够调节人体免疫功能，进而起到改善物质代谢、增强抗应激功能、延缓衰老等作用，从而可用于保健品。 

另外，本发明的苦荞提取物还可通过诱导DC成熟，提高DC疫苗的效率和细胞免疫效果，来作为DC疫苗的增强剂。 

附图说明

图1为纯化条件图； 

图2为本发明制备的苦荞凝集素的SDS-PAGE分析图，其中： 

泳道1：Mr：低分子量标准蛋白；泳道2：Resource Q纯化收集物，收集的Peak II；泳道3：Sephadex G75凝胶柱纯化的凝集素，收集的Peak IV；