[发明专利]一种从鳀鱼中分离的活性多肽

说明书

技术领域

本发明属于多肽分离技术领域，具体涉及一种从鳀鱼中分离的活性多肽，具有抗神经细胞损伤的功能。

背景技术

鳀鱼广泛分布于太平洋西北部、新西兰、澳大利亚、印度洋、非洲东岸及南非沿岸等南北半球的温带水域，是世界上单一渔业品种产量最高的鱼种，系集群性小型中上层鱼类，资源丰富。由于鳀鱼富含脂肪、酶活高、易被氧化而腐烂变质，因此不能长期储存，我国俗称“离水烂”。我国东海、黄海和渤海均产之，资源丰富，年渔获量可达几十万吨。长期以来由于对其利用价值认识不足，未被大规模的开发利用。而随着人们生活水平的提高，鳀鱼很少直接食用，大多仅被简单加工成养殖用的饲料、鱼糜；而且在加工过程中会产生大量鳀鱼副产物，这些副产物如果随意丢弃而不加以利用会带来极大的环境污染及资源浪费。鳀鱼有很高的营养价值，含有8种人体必须氨基酸、不饱和脂肪酸和牛磺酸，另外还富含维生素A、E等。此外，鳀鱼及其加工副产物作为一种重要的海洋蛋白资源，在氨基酸组成和序列上与陆地生物蛋白资源有很大差异，且在种类和数量上都远远大于陆地及淡水蛋白资源，然而这些资源并未得到充分利用。如果能将其进一步开发和利用，将大幅提高鳀鱼及其副产物的附加值，为充分利用这一海洋资源开辟新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种从鳀鱼发酵液中分离的活性多肽，从而弥补现有技术的不足。

本发明的活性多肽，是从鳀鱼中分离的，其制备方法包括如下的步骤：

1)将鳀鱼浓缩液加入2～6倍体积的水后，再加入鳀鱼浓缩液重量1～8％的蛋白酶，在40～70℃下酶解2～24h制成酶解液；

其中鳀鱼浓缩液将鳀鱼或鳀鱼加工的副产物粉碎，过滤除去杂质后，滤液在80～100℃加热0.5～10h至粘稠半固态状得到的；

2)在步骤1)的酶解液中加入鳀鱼酶解液重量1％～10％的麸皮，灭菌后接入米曲霉发酵3～7d获得发酵液；

3)将步骤2)制备的发酵液过滤，滤液灭菌后得到鳀鱼发酵母液成品；

4)将步骤3)得到的鳀鱼发酵母液成品进行冷冻干燥成干粉后，再用超纯水溶解，溶解液通过滤膜过滤后，滤液用葡聚糖G-15进行分离，上样量为0.2～2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2～2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱27～30min的洗脱液；

5)将步骤4)得到的洗脱液浓缩后用DEAE-Sepharose FF离子交换柱层析进行分离纯化：浓缩后的样品上pH7.5～8.5的5mM Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF离子交换柱，采用浓度为2mol/L NaCl梯度洗脱，流速为0.2～2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱3～6min的洗脱液；

6)将步骤5)得到的组份进一步过SB-C₁₈半制备柱，柱温25℃，上样量20～100μL，紫外波长220nm，流速0.5～2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1～1％的三氟乙酸；分管收集12～13.5min的洗脱液，干燥后即为分离的抗神经细胞损伤活性多肽。

本发明得到的抗神经细胞损伤多肽分子量为2,181Da。

上述方法制备的活性多肽，用4.6×250nm的XDB-C₁₈分析柱测定分离多肽的纯度；流速为0.5～2mL/min，其中流动相A为甲醇，流动相B为水。

上述的蛋白酶包括各种来源的蛋白酶：植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶等)；以及各种条件的蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各种蛋白酶按照一定比例复配得到的复合蛋白酶(风味蛋白酶等)。

本发明的活性多肽分子量为2,181Da，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性活性的多肽。本发明获得的多肽在谷氨酸盐对神经细胞损伤模型中，本发明的活性多肽的加入可以显著提高PC12神经细胞的存活率，在终浓度为50μg/mL时，细胞存活率与损伤组比较提高了26.4％，有效地减轻了谷氨酸盐诱导的神经细胞损伤。另外，对其神经细胞保护作用的细胞机理研究发现，活性多肽的加入显著增加了胞内的总抗氧化能力，且对SOD活力的增加有一定促进作用。

附图说明

图1：G-15凝胶柱层析洗脱图谱；

图2：P₂洗脱峰获得的多肽的DEAE-Sepharose FF离子交换柱色谱图；