[发明专利]纤维酶体基因的改建方法及获得的新型纤维素酶

说明书

 所属技术领域：

本发明涉及一种纤维酶体基因的改建方法及通过基因改建获得的新酶，具体涉及一种以热纤梭菌的纤维酶体和它的单体酶为基础的基因改建方法，及基因改建产生的新型木质纤维水解酶，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术：

木质纤维是地球植物的支撑组织，主要成分是通过光合作用碳水化合物，是非常丰富的自然资源。同时，自然界很多微生物和植食性动物能够产生一系列酶对木质纤维进行水解，从而构成自然界碳素循环的重要环节。水解木质纤维中纤维素成分的主要酶类包括纤维素酶、纤维素外切酶、纤维二糖酶和b-葡萄糖苷酶等。纤维素酶是b-1,4葡聚糖内切酶的简称；纤维素酶的催化反应是纤维素水解中的限速步骤。

纤维素酶在纤维素利用与加工中具有广泛的用途。在造纸工业，纤维素酶在废纸的脱墨处理中是重要的生物催化剂，同时在机械制浆前以纤维素酶预处理可以增加纸浆的强度性能，显著降低机械磨浆时的能量消耗；在纺织工业，利用纤维素酶对棉织物及其混纺织物进行打磨刨光处理，可使织物的硬度适当下降，织物的悬垂度、 回弹性及柔软度获得改善；作为饲料添加剂，纤维素酶能够提高青贮饲料的品质，加强机体对营养物质的吸收，改善瘤胃的发酵功能，从而增加动物体的日增质量，改善产奶量和奶品质，提高经济效益。另外纤维素酶在食品加工和中草药加工等领域也有广泛的用途。但是，植物产生的纤维素结构致密，对纤维素酶的攻击具有很强的抵抗能力；迄今发现的所有天然纤维素酶都只能以有限的速度，缓慢地水解自然的结晶态纤维素。 

热纤梭菌（Clostridium thermocellum）是1种嗜热厌氧细菌；它能够在细胞表面产生一种水解纤维素和半纤维素酶的多酶聚合体，即纤维酶体（cellulosome）。由于来源于嗜热细菌并且有多种酶的协同作用，纤维酶体的稳定性较好、降解纤维素的表观活性很高。因此几十年来，纤维酶体吸引了大批学者对其进行研究。纤维酶体的结构已经得到充分解析：纤维酶体的中心有1个支架蛋白，它的肽链中有个纤维素结合域（CBD）和多个粘连域（cohesin）；纤维酶体的支架上吸附了多种酶的单体，其中包括纤维素酶、木聚糖酶等；各单体酶的肽链中都具有一段保守的序列，称为锚定域（dockerin），单体酶被分别合成并分泌到细胞表面后以锚定域与支架上的粘连域相结合，从而形成多种酶的聚合体。纤维酶体通过CBD附着到纤维素微丝上对其进行消解。纤维酶体中的多种单体酶附着于同1个支架并共用同1个纤维素结合域（CBD），这种结构不利于通过基因超量表达生产。 

在分子生物技术高度发展的今天，我们发现纤维酶体的生产有其致命的弱点：（1）纤维酶体产生菌是嗜热厌氧细菌，培养条件苛刻，细胞密度低，发酵产酶的效率非常低；（2）纤维酶体由多个基因编码，总分子质量超过2000 kDa，难以进行体外重组表达；（3）纤维酶体含有近20种不同的单体酶，其中许多单体并不是纤维素水解所必需的，还有些单体酶的活性不及其他来源的同类酶，因而，生产这些单体酶是生物能量的浪费；（4）纤维酶体中各种单体酶的活性有赖于支架上的CBD，离开支架后单体酶的催化活性下降。 

发明内容

本发明的目的：

纤维酶体中的各个单体都由独立的基因编码，这些基因都可以通过基因异源高效表达重组进行生产。但是没有支架蛋白的纤维素结合域(CBD)的作用，重组酶的活性不能充分发挥，而此时亚基上锚定域也成为多余。要解决的技术问题是建立一种对纤维酶体中的单体酶进行分子改建的方法，将纤维酶体中依赖于支架蛋白的单体酶构建成独立酶，获得生物活性明显提高的新型木质纤维水解酶，并使新酶得到异源可溶性高效表达，形成高产技术。

技术方案： 

本发明采用的技术方案是通过基因重组技术，切除纤维酶体的单体酶肽链中的锚定域以减少冗余部件、用1个短链将支架蛋白上的CBD嫁接到单体酶的分子上，获得具有不同分子结构、能够独立结合底物、比单体酶活性高的新型独立酶。本技术方案在本发明中应用于、但是不限于纤维酶体中CelD的分子改建。