[发明专利]基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及制备方法

权利要求书

1.一种基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸，包括底层的支撑层、中间层的吸附层和固定在吸附层上的保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于：在纤维素膜层上设有用展示OTA模拟表位的M13噬菌体印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体采用胶体金纳米颗粒标记的OTA的单克隆抗体或多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述OTA模拟表位的多肽序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述M13噬菌体由以下方法筛选，具体步骤为：

（1）亲和筛选M13噬菌体随机七肽库

取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100μL，其中含噬菌体1×10¹¹~2×10¹¹pfu，室温下轻摇震荡1h，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后，每孔加入100μL pH2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E. coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37℃震荡培养4-5h，4℃、12000rpm离心10min，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀过夜；沉淀后，4℃、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min；再4℃离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮；

测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为1×10¹¹~2×10¹¹pfu，包被的抗体量分别为75、50和25μg/ml；TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第1轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的E.coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度；

（2）鉴定噬菌体克隆

取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，加入要鉴定的噬菌体克隆，37℃作用1h，用PBST溶液洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记的抗M13的单克隆抗体，37℃作用1h，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加入2mol/L的H₂SO₄终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值≥空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；

然后采取竞争ELISA方法鉴定阳性噬菌体克隆的敏感性，加入不同浓度的OTA稀释液和阳性噬菌体，于37℃作用1h，用PBST溶液洗涤6次；加TMB显色液，加2mol/L的H₂SO₄终止反应，测定在450nm波长下的吸光度OD值，不加噬菌体克隆的孔作空白对照，以待测孔的吸光度OD值≥空白对照中OD值的2.1倍，判断为阳性；计算各浓度下噬菌体的结合率，并作标准曲线判断噬菌体克隆的敏感性；

（3）DNA测序及多肽序列分析

将扩增后的噬菌体进行测序，根据插入的DNA序列翻译出氨基酸序列，采用的- 96 gⅢ测序引物为5′- ^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′，模拟表位的氨基酸序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。

4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫层析试纸，其特征是：所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成，支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。