[发明专利]基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种以展示有OTA模拟表位的M13噬菌体作为检测印记，用于快速检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

赭曲霉毒素（Ochratoxin）是曲霉属和青霉属的某些菌株产生的次级代谢产物，它包含七种结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农作物污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA），其作用的靶器官主要是肾脏和肝脏，是一种强烈的肾、肝毒素，并具有较强的致癌、致畸和致突变作用。由于OTA广泛存在于农产品及畜产品，且能经食物链进入人体，对人类生命健康造成危害，因此，如何实现对OTA的快速、准确检测意义重大。

目前，对OTA检测方法有化学分析法、仪器分析法和免疫学分析法等。其中免疫学分析法以敏感度高、检出限低的优势在OTA定性、定量检测中广泛应用，实现了OTA快速、简便、高灵敏检测，对保障我国农产品安全有着积极意义。但是，免疫学检测方法是建立在以标记毒素或偶联毒素为竞争抗原基础上的有毒检测体系，存在毒素标品昂贵，对生产及操作人员的健康有害，以及偶联反应重复性差等缺陷，制约了它的应用和推广。

近年来，利用噬菌体随机肽库技术得到的模拟表位肽替代毒素作为竞争抗原，建立的无毒检测体系，推动了OTA免疫学检测的快速发展。噬菌体随机肽库技术是以大量随机编码的多肽序列插入噬菌体展示载体，形成噬菌体展示文库。每个噬菌体粒子或者噬菌体只展示一种序列的外源肽链，不同的噬菌体粒子或者噬菌体展示不同序列的外源肽链。

免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，用作OTA的检测有独特优势，是需要优先发展的检测技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，提供一种安全、特异、灵敏、简便、快速检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸及其制备方法。

本发明的技术方案：

一种基于M13噬菌体检测赭曲霉毒素A的免疫层析试纸，包括底层的支撑层、中间层的吸附层和固定在吸附层上的保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用展示OTA模拟表位的M13噬菌体印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述金标抗体纤维层采用吸附金标抗体的玻璃纤维棉制成，金标抗体采用胶体金纳米颗粒标记的OTA的单克隆抗体或多克隆抗体。

所述OTA模拟表位的多肽序列为MPLWXDL，X为任意氨基酸。

所述M13噬菌体由以下方法筛选，具体步骤为：

（1）亲和筛选M13噬菌体随机七肽库

取包被有OTA单克隆抗体的ELISA板，每孔加入稀释后的噬菌体肽库100μL，其中含噬菌体1×10¹¹~2×10¹¹pfu，室温下轻摇震荡1h，弃去液体；沉淀用TBST溶液洗涤10次，洗去未结合的噬菌体后，每孔加入100μL pH2.2的洗脱液Gly-HCl，室温下轻摇震荡8min，吸出洗脱液，加入中和缓冲液至中性；中和后的洗脱液除留一部分作滴度测定外，其余的洗脱液接种处于对数生长前期的E. coli ER2738的LB培养液中，进行扩增培养；于37℃震荡培养4-5h，4℃、12000rpm离心10min，向上清液中加入占上清液1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀过夜；沉淀后，4℃、12000rpm离心15min，弃上清，再用TBST溶液悬浮噬菌体，加入占TBST溶液1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育60min；再4℃离心15min，去上清，沉淀用TBST溶液悬浮；

测定滴度后，进行第2次、第3次和第4次亲和筛选；每次加入噬菌体的量为1×10¹¹~2×10¹¹pfu，包被的抗体量分别为75、50和25μg/ml；TBST溶液中Tween-20的含量从第2次筛选起增至0.5%，其余步骤与第1轮筛选相同，第4次筛选后的洗脱产物经滴度测定后，从总量不到100个噬菌斑的平板上挑选若干蓝色噬菌斑，分别接种处于对数生长期前期的E.coli ER2738的LB培养液中进行扩增培养，纯化并测定滴度；

（2）鉴定噬菌体克隆