[发明专利]一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种构建双T-DNA载体的方法，其特征在于，所述双T-DNA载体为pTRIDT313，包括以下步骤：

(1)以pCMBIA1302载体为模板，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物，分别进行PCR扩增得到T-DNA左右边界LB和RB，LB引入酶切位点SphI和BglII，RB引入酶切位点SacI和SphI；

(2)将左右边界LB和RB分别连到pMD19-T载体，与骨架载体pCAMBIA1302分别进行酶切，再用T4连接酶进行三片段连接，得到含两套T-DNA边界的双T-DNA载体pTRIDT313。

2.含有双报告基因的双T-DNA载体，其特征在于，该载体具有两个T-DNA区域，一个T-DNA区域含有报告基因GUS和选择基因，另一个T-DNA区域含有报告基因GFP和目的基因。

3.如权利要求2所述的含有双报告基因的双T-DNA载体，其特征在于，所述选择基因为潮霉素磷酸转移酶基因hpt、氯霉素磷酸转移酶基因cat、新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ、除草剂抗性Bar基因。

4.如权利要求2或3所述的含有双报告基因的双T-DNA载体，其特征在于，其为pTRIDT314。

5.如权利要求2或3所述含有双报告基因的双T-DNA载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)双T-DNA载体的构建，包括：

1)以pCMBIA1302载体为模板，以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物，分别进行PCR扩增得到T-DNA左右边界LB和RB，LB引入酶切位点SphI和BglII，RB引入酶切位点SacI和SphI；

2)将左右边界LB和RB分别连到pMD19-T载体，与骨架载体pCAMBIA1302分别进行酶切，再用T4连接酶进行三片段连接，得到含两套T-DNA边界的双T-DNA载体pTRIDT313；

(2)含GUS基因的中间载体的构建，包括PCR扩增得到GUS基因，将其连接到pMD19-T载体，通过限制性酶切位点将pTRIDT313载体潮霉素磷酸转移酶基因替换成GUS基因，得到含GUS基因的中间载体pTRIDT313-GUS；

(3)将中间载体pTRIDT313-GUS和连接选择标记基因的T载体经SacI和EcoRI酶切后连接，选择标记基因插入中间载体pTRIDT313-GUS后，即得到含有双报告基因的双T-DNA载体。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增得到GUS基因使用的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述限制性酶切位点为XhoI。

8.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因。

9.如权利要求2～4任一所述的含有双报告基因的双T-DNA载体在筛选无选择标记的转基因植物中的应用。

10.如权利要求2～4任一所述的含有双报告基因的双T-DNA载体在检测转基因植物中的应用。