[发明专利]一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种含有双报告基因的双T-DNA载体及其构建方法和应用。

背景技术

粮食问题是各个国家的核心问题，由于环境的恶化，耕地面积的大量减少，人口的不断增长，我国的粮食问题面临着越来越大的挑战，解决好粮食安全问题是保证经济高效和可持续发展的重要前提。实践表明，科学技术的发展与突破是解决粮食问题最重要的途径之一，利用基因工程技术改良农作物品种，提高农作物的品质和产量具有越来越重要的现实意义。

转基因技术始于上世纪八十年代，该技术从出现即得到广泛的关注与应用，到现在植物转基因技术已成为提高作物产量、品质，农业资源利用率，改善农业生态环境等的有效手段之一。目前，转基因植物主要包括经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、果树以及牧草等。从1996年第一批转基因作物商业化应用以来，转基因作物的种植面积逐年增加，到2012年其种植面积增长了100倍(ISAAA,2012)，转基因技术亦成为近代农业史上发展利用最快的新技术之一。但是，随着该技术的迅猛发展，人们在关注转基因植物带来巨大经济和社会效益的同时，其安全问题也引起了人们普遍的关注。在植物转基因过程中，外源基因在植物受体细胞中的转化频率相当低，为了快速方便的从庞大的受体细胞群中得到真正的转化细胞，特异性的选择标记基因被广泛的应用于转基因过程中。然而，选择标记基因的安全性却受到人们的质疑，主要表现在：目前被广泛应用的选择标记基因主要是抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，这些基因可能会转移到微生物中，使得病原菌获得抗性，从而导致临床使用的抗生素失效；此外，可能发生基因漂流，经自然杂交传递到野生杂草中，产生抗药性超级杂草，对农业生产和生态环境带来极大的危害；最后，这些基因及其产物可能会对动物和人类健康安全产生负面影响。因此，提高转基因植物标记基因的安全性是现今植物转基因技术的重要目标和迫切任务。

目前，提高转基因植物中选择标记基因安全性的策略主要有：使用无选择标记基因的转化系统；利用无争议的生物安全标记基因；剔除已获得转基因植株的选择标记基因。使用无选择标记基因的转化系统，转基因阳性植株筛选的工作量巨大，费时费力；利用无争议的生物安全标记基因操作简单，是目前最为常用的方法；而剔除标记基因则可以完全避免选择标记基因所带来的安全隐患，并有利于多基因转化。因此，利用无争议的生物安全标记基因和剔除转基因植株选择标记基因成为当前转基因研究的主要手段。

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即一种表达产物非常容易被鉴定的基因。GUS基因(β-D-葡萄糖苷酸酶基因)是目前常用的一种报告基因，其表达产物β-葡萄糖苷酸酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷酸，将5-溴-4氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸脂(X-Gluc)分解为蓝色物质，其检测方法简单、快速、灵敏、稳定，且背景活性低。另一种常用的报告基因是绿色荧光蛋白(GFP)基因，GFP是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，在受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光，其检测方便，只需激发光源，不需任何底物或辅助因子，且材料可活体观测，同时，GFP生色基团的形成无种属特异性，在原核真核细胞中都能表达，其表达产物对细胞基本没有毒害作用，并且不影响细胞的正常生长和功能。GFP基因是近年来发现的生物安全标记基因之一。

剔除转基因植株选择标记基因的方法主要有位点特异性重组、转座子系统以及共转化系统。其中，共转化法是研究比较多，应用比较成熟的方法，它具有操作简便，适用范围广，基因转化效率较高等优点，因而被广泛应用于水稻、烟草、油菜、大豆、玉米等植物中。共转化法是将选择标记基因和目的基因分别构建在2个不同的载体上，共同转化植物受体细胞，获得转基因共整合的植株，再经过转化植株有性阶段的遗传重组，使选择标记基因与目的基因分离，得到剔除了选择标记基因的阳性转化植株。但是，由于不同植物转基因载体的基因共整合效率有差异，而且易整合在受体基因组的同一位置，使其应用受到了限制。为了解决这个问题，研究者又构建了含有两个T-DNA的超级双元载体，即选择标记基因和目的基因分别插入到同一质粒而又相互独立的T-DNA区内，这有效提高了共整合效率，但是在得到的共整合转化细胞中，有大部分双T-DNA整合在了基因组的同一位点，使得在后代遗传中，双T-DNA载体上的基因不能分离，无法得到无选择标记基因的转基因阳性植株，如何在转基因后代中简单快速剔除含选择标记基因的共整合植株是提高共转化效率和培育无选择标记基因安全转基因植株的关键所在。

发明内容