[发明专利]转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；

外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；

内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；

内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；

环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）。

2.转基因植物中cry3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物1和内引物2的浓度依次为4~6 μmol/L、4~6 μmol/L、32~48 μmol/L和32~48 μmol/L；

（2）环引物溶液：由权利要求1所述的环引物配制而成，环引物的浓度为16~24 μmol/L；

（3）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9 U/μL；

（4）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH₄)₂SO₄，40~100 mmol/L MgSO₄，6~14 mol/L甜菜碱；

（5）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（6）阳性DNA对照样品，转cry3A基因植物的基因组DNA，或含有cry3A基因序列的大肠杆菌质粒DNA；

（7）阴性DNA对照样品：不含cry3A基因序列的DNA。

3.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的检测引物溶液中含有5 μmol/L外引物1、5 μmol/L外引物2、40 μmol/L内引物1、40 μmol/L内引物2。

4.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的环引物溶液中含有20 μmol/L环引物。

5.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μL。

6.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10×反应缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L、8 mol/L。

7.利用权利要求2~6任一项所述的试剂盒检测cry3A基因的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5 μL、环引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；

（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；

（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（5）LAMP扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果、或取2~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

8.根据权利要求2~6任一项所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括显色剂，所述显色剂为SYBR GREEN I荧光染料。

9.利用权利要求8所述的试剂盒检测cry3A基因的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5 μL、环引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；

（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；

（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（5）LAMP扩增结果的鉴定：在反应管中加入1~2 μL 显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。