[发明专利]转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因植物中cry3A基因的引物组、试剂盒和检测方法。 

背景技术

2013年全球转基因作物种植面积高达1.752亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫、抗除草剂。在抗虫转基因植物中应用的目的基因有cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、cry1F、cry2Ab、cry3A、cry3Bb、vip3A、cry9C等，其中cry3A基因存在于转基因玉米MIR604中，已获准在美国、欧盟、澳大利亚、俄罗斯、韩国、南非等近20个国家和地区商业化种植或作为食品和饲料，我国也在2008年批准转基因玉米MIR604进口用作加工原料。 

为加强转基因生物及其产品的安全管理，全球50多个国家和地区制订了转基因生物标识制度。我国于2001年相继颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及安全评价、标识管理、进口安全、加工审批等一系列配套管理办法，对转基因生物进行全产业链监管，要求对转基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5类17种产品实施强制性标识管理制度。 

转基因检测技术是转基因生物安全管理的重要技术支撑。目前转基因检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，PCR方法应用最为广泛，但基于PCR技术的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4 h），难以实现现场快速检测，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。 

LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1 h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。 

LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因植物中cry3A基因的检测方法和试剂盒。 

发明内容

本发明的一个目的在于公开一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组。 

本发明的另一个目的在于公开一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测试剂盒。 

本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因植物中cry3A基因的LAMP检测方法。 

本发明所采用的技术方案如下： 

根据cry3A基因的核苷酸序列，设计cry3A基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~5；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性、灵敏度进行验证。

转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物，其核苷酸序列分别如下所示： 

外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；

外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；

内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；

内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；

环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）。

转基因植物中cry3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：