[发明专利]一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法

权利要求书

1.一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’

下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；

利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；

用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；

利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。

2.根据权利要求1所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，具体为：

如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开或存在一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；

如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；

如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。

3.根据权利要求1所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述酶切的体系包括PCR产物9ul、限制性内切酶0.2ul和缓冲液1ul；所述酶切的条件为37℃孵育1-8h，65℃热失活20min。

4.根据权利要求3所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述酶切的条件为37℃孵育2h，65℃热失活20min。

5.根据权利要求1至4任一所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O至20ul。

6.根据权利要求5所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-65℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸7min。

7.根据权利要求6所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增进行35个循环。

8.根据权利要求7所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件：在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为61℃时退火30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。