[发明专利]一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。

背景技术

牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种，酪蛋白在牛奶蛋白中的含量约占80％左右，乳清蛋白约占14％。牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白，αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％。

β-酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G。目前大多数养殖奶牛生产的β-酪蛋白，主要为A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白两种类型。在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4-11个氨基酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽——β-酪啡肽，BCM7(Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile)就是从这类多肽中分离出来的一种类似吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由A1-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生，这是由于A2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有比较稳定的二级结构，而A1-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面的疾病。

A1β-酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研究，A1β-酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世界卫生组织。新西兰流行病学证据表明A2牛奶比A1牛奶更有益于人类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中A1牛奶与心脏病发病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与A1牛奶的消耗有很强的关联性(s＝0.86)。Elliott比较了10个国家0-14岁儿童I型糖尿病的发病率，A1β-酪蛋白与其有较大的关联性(s＝0.726)，在冰岛，由于当地的奶牛主要为A2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病率很低。动物学实验也表明表明，喂养A1牛奶的兔子与喂养A2牛奶的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。

因此，我们需要找到一种能够有效区分A1奶牛和A2奶牛的方法，从而使得养殖场只繁育A2奶牛，但目前的检测方法无法检测出β-酪蛋白不同的基因型，不能保证人们喝的牛奶为A2牛奶。

发明内容

鉴于目前检测β-酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本发明提供一种检测出β-酪蛋白不同的基因型的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：

根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：

上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’

下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；

利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；

用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；

利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。

依照本发明的一个方面，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，具体为：

如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开或存在一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；

如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；

如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。

依照本发明的一个方面，所述酶切的体系包括PCR产物9ul、限制性内切酶0.2ul和缓冲液1ul；所述酶切的条件为37℃孵育1-8h，65℃热失活20min。

依照本发明的一个方面，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述酶切的条件为37℃孵育2h，65℃热失活20min。

依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O至20ul。