[发明专利]酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法

权利要求书

1.一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)通过酵母发酵获得正确构象的重组门冬胰岛素原；

(2)金属螯合层析和阳离子交换层析纯化门冬胰岛素原；

(3)赖氨酰内肽酶单一酶切制备缺失B30位苏氨酸的门冬胰岛素；

(4)缺失B30位苏氨酸的门冬胰岛素偶联苏氨酸酯及脱保护；

(5)门冬胰岛素的反相精纯化及结晶；

所述重组门冬胰岛素原的氨基酸序列为：

EEAEAEAEPKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKX_aaWKGIVE QCCTSICSLYQLENYCN

其中，序列第1位至10位为引导肽，11-39为B链肽段，40-42为短C肽肽段，43-63为A链肽段，X_aa为Met或Glu。

2.根据权利要求1所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述酵母为巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母。

3.根据权利要求2所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述酵母为巴斯德毕赤酵母。

4.根据权利要求1所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述赖氨酰内肽酶单一酶切所用的酶切缓冲液为Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，或者硼酸盐缓冲液。

5.根据权利要求4所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述赖氨酰内肽酶单一酶切所用的酶切缓冲液为20～100mMTris-HCl缓冲液。

6.根据权利要求4所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于赖氨酰内肽酶与门冬胰岛素原的质量比介于1：3000～30000。

7.根据权利要求1所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述缺失B30位苏氨酸的门冬胰岛素偶联苏氨酸酯的转肽反应的反应体系中蛋白浓度为10～30g/L，DMF/EtOH(V/V)为40～70％，去离子水含量为10～30％，蛋白与叔丁醚苏氨酸叔丁酯质量比为1：3～20，pH为5.5～8.5，反应温度为20～37℃。

8.根据权利要求1所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述脱保护步骤为：取30～100％TFA的二氯甲烷(DCM)，按蛋白含量(mg)与DCM/TFA混合液体积(ml)比为10～50：1补加DCM/TFA混合液，反应温度为10～25℃，反应时间0.5～1.5小时。

9.根据权利要求1所述的一种门冬胰岛素在酵母中重组表达及制备方法，其特征在于，所述结晶方法如下：取重组门冬胰岛素真空低温冻干，在10～30℃条件下，配置含20～200mM柠檬酸三钠、3.0～10.0g/L重组门冬胰岛素、体积分数为10～30％的乙醇、0.2～0.5％的间甲酚、0.2～1.0M氯化钠结晶液、并调节结晶液pH至6.0～6.5、按锌离子与门冬胰岛素的摩尔比为2～15:1补加锌离子，结晶3～6小时，然后降温至2～8℃静置10～20小时，获得门冬胰岛素结晶。