[发明专利]酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法

说明书

酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法。本发明公开了一种毕赤酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法。具体包括在酵母中高效分泌表达重组人门冬胰岛素原、赖氨酰内肽酶单一酶切获得缺失B30的门冬胰岛素、偶联苏氨酸酯、脱保护、反相纯化及结晶的工艺过程。本发明方法更适合重组门冬胰岛素工业化制备。

技术领域

本发明属于生物技术下重组蛋白的制备领域。本发明公开了由酵母重组表达门冬胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗导致的以高血糖为特征的代谢紊乱病症。目前，中国已成为世界上糖尿病患者人数最多的国家。糖尿病已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大危害性疾病。糖尿病患者常常伴有多种并发症，容易导致肾脏、眼、心脏和血管等众多器官损害、功能性障碍和衰竭，危害性极大。

由于饭后葡萄糖的峰值与注射胰岛素的峰值到达时间的偏离，给胰岛素注射液的应用带来困难，从而推动了单体胰岛素类似物的产生。上世纪末，人们开发出了速效胰岛素—重组门冬胰岛素，是将人胰岛素B链B28位脯氨酸（Pro）突变为天门冬氨酸（Asp）。此改变，破坏了两个胰岛素单体分子在形成二聚体时重要的范德华力，使其不易形成二聚体。重组门冬胰岛素制剂注射后，其药代动力学接近人胰岛素的生理分泌曲线。与常规人胰岛素相比，其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右，起效时间为10~20分钟，达到峰值时间为40分钟，作用持续时间3~5小时，既有效控制了血糖，也不会造成夜间严重的低血糖事件。

在中国专利CN98813941.3 中，公开了一种制备重组胰岛素类似物的方法，该方法在获得正确构象的胰岛素原后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正确构象的Arg(B31)-胰岛素，纯化后再用羧肽酶B 去除Arg(B31)-胰岛素C端的Arg，形成正确构象的胰岛素，最后再用HPLC 纯化。

在中国专利CN103305581A中，公开了一种制备重组胰岛素的方法，该方法中通过用胰蛋白酶酶切，然后偶联B30的苏氨酸，最后得到普通胰岛素。但其方法不适合门冬胰岛素的制备，因胰蛋白酶无法酶切B28-29为Asp-Lys的Lys的羧基端肽键。

在中国专利CN102159588A 中，公开了一种制备门冬胰岛素的方法，该方法中通过构建含有B30苏氨酸的门冬胰岛素原，然后胰蛋白酶和羧肽酶B同时酶切门冬胰岛素原的方法，获得门冬胰岛素。该方法的得率低于70%，且酶用量偏高。

在中国专利CN1589328A 中，公开了一种制备门冬胰岛素的方法，该方法中通过选用无色杆菌蛋白酶Ⅰ酶切，酶切完成后直接改变条件转肽，偶联苏氨酸酯。

本发明专利中公开了重组门冬胰岛素的制备方法。该方法通过巴斯德毕赤酵母分泌表达含有三对二硫键正确构象的门冬胰岛素原后，用赖氨酰内肽酶高效单一酶切，得到缺失B30位的门冬胰岛素，然后在赖氨酰内肽酶作用下偶联叔丁醚苏氨酸叔丁酯（苏氨酸酯）；再脱去保护基团，经反相精纯化和结晶，得到重组门冬胰岛素。本发明工艺中，酶切、偶联效率高，且偶联后相关物质的反相色谱中行为差异显著，易于精纯化，更适合工业化制备重组门冬胰岛素。

发明内容

本发明提供了重组门冬胰岛素新的表达途径，以及重组门冬胰岛素原单一酶切和偶联方法，从而提高重组门冬胰岛素的工艺水平和生产能力。

本发明中，重组门冬胰岛素制备工艺具体包括以下步骤：

）通过酵母发酵获得正确构象的门冬胰岛素原；

）金属螯合层析和阳离子交换层析纯化门冬胰岛素原；

）选用赖氨酰内肽酶酶切门冬胰岛素原，获得缺失B30位的门冬胰岛素；

）B30位偶联苏氨酸酯；

）反相纯化步骤样品；

）步骤样品的脱保护及反相精纯化；

）结晶步骤样品。