[发明专利]一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及河豚毒素检测方法及试剂盒，具体涉及一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法及基于该方法的试剂盒。

背景技术

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是日本学者Dr. Yoshizumi Tahara于1909年首次从河豚肝脏中提取并发现的一种氨基全喹啉化合物神经毒素，分子量约为319.3Da。普遍存在于河豚、织纹螺、蟹、海星、虾虎鱼等海生生物，蝾螈、蛙、蛇等陆栖动物，甲藻、红藻等藻类以及细菌等生物中。TTX毒性极强，1 mg等于4500MU，对哺乳类静脉注射半致死剂量LD50为2～10 μg/kg，皮下注射LD50为10～14μg/kg，对人类的最低急性中毒剂量约为0.2mg，致死摄食剂量0.6～2mg/50kg体重。由于其热稳定性高，普通烹饪手段如在100℃加热难以破坏，常常引发吃食河豚、织纹螺等中毒。小鼠生物法、酶联免疫法（ELISA）、液质联用法（LC-MS）和高效液相柱后衍生荧光检测法（HPLC-FLD）等为河豚毒素检测常用方法，但由于均存在一定的缺陷，如小鼠法不能专一地检出TTX，ELISA容易出现假阳性，LC-MS检测成本昂贵，柱后衍生HPLC-FLD需要配备柱后衍生装置和昂贵联用质谱仪确证。荧光检测技术具有背景干扰低、灵敏度高、精确、成本相对低廉的特点，因此开发一种新型荧光检测手段，将有利于促进河豚毒素的检测工作。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，该方法用于定性、定量检测水产品中河豚毒素(TTX)，结果可靠、检测限低。

本发明的目的之二是提供基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法的试剂盒。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现：一种河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法，包括以下步骤：

(1) 制备待测品的样品溶液及河豚毒素标准品溶液；

(2) 荧光衍生：取样品溶液0.4m L，加入0.2m L pH维持液，将溶液pH控制在11.6~11.9区间，然后加入0.1mL衍生试剂1和0.1mL衍生试剂2，混匀，水浴加热20min，冷却至室温，加入0.1mL终止液，使溶液pH呈中性，而后用超纯水定容；取样品溶液，加入河豚毒素标准品溶液混匀，然后进行本步骤操作进行荧光衍生；

(3) 定性和定量检测：采用配备荧光检测器的液相色谱仪对步骤(2)荧光衍生后的样品溶液和河豚毒素标准品溶液进行分析，对样品溶液中的河豚毒素进行定性和定量。

本发明所述步骤(1)中待测品的样品溶液的提取和纯化采用已有技术即可，例如，将待测品均质，用乙酸溶液在水浴超声提取后，所得提取液上河豚毒素亲和层析柱或WCX固体萃取柱等洗脱，获得的洗脱液经水浴氮气吹干后再制成样品溶液。

本发明所述步骤(1) 河豚毒素标准品溶液中河豚毒素浓度为20~10000ng/ml。

本发明所述步骤(2)中pH维持液为2mol/L碳酸钠溶液。

本发明所述步骤(2)中衍生试剂1的 pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5﹕2﹕3，具体地，所述a液为次溴酸钠贮备液：0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至10mL；所述b液为 5mol/L盐酸；所述c液为 4.81mol/L氢氧化钠。

本发明所述步骤(2)中衍生试剂2为20%尿素（w/v）。

本发明所述步骤(2)中终止液为15%磷酸（w/v）。

本发明所述步骤(3)中高效液相色谱检测条件为：色谱柱：反相C-18柱；流动相：50 mmoL/L磷酸二氢铵；检测信号：激发波长233 nm，发射波长370 nm。

本发明的第二个目的通过以下技术措施来实现：基于上述河豚毒素柱前衍生-高效液相荧光检测方法用试剂盒，包括以下试剂：

(1) 衍生试剂1：pH约为12，包括a液、b液和c液，a液、b液和c液之间的体积比为5﹕2﹕3，所述a液为次溴酸钠贮备液：0.67g溴酸钠、3.0 g溴化钠，用蒸馏水溶解并定容至10mL；所述b液为 5mol/L盐酸溶液，10mL；所述c液为 4.81mol/L氢氧化钠溶液，10mL；

(2) 衍生试剂2：20%尿素溶液（w/v）。

(3) pH维持液：2mol/L碳酸钠溶液；

(4) 河豚毒素标准品贮备液：100μg/mL河豚毒素溶液，内含1mmol/L的柠檬酸盐，pH=5.0；

(5) 终止液：15%磷酸溶液（w/v）。