[发明专利]2‑酮基‑L‑古龙酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及2-酮基-L-古龙酸的制备方法。

背景技术

目前国内生产古龙酸多采用二步发酵法，二步发酵法通常采用混合菌系进行发酵。在二步发酵过程中，为提高发酵产率，多采用流加工艺：流加山梨糖和碳酸钠。流加碳酸钠的目的主要是调控pH值，反应产物是可溶的古龙酸钠。山梨糖作为流加碳源，在转化率一定的情况下，山梨糖流加量的多少，将直接代表二步发酵时2-酮基-L-古龙酸的产酸率。

行业内山梨糖的生产主要是利用黑醋菌发酵转化山梨醇而获得。黑醋菌的发酵能力较强，30小时左右可以将发酵醪液中(山梨醇浓度为250-300mg/mL)的山梨醇转化成山梨糖。在此发酵醪液中山梨糖浓度为240-300mg/mL。将发酵结束的醪液作为底料碳源或流加碳源接入二步发酵罐内，由混合菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸。

采用流加碳源发酵生产工艺，是解除高浓糖反馈抑制的经典方法，在抗生素、氨基酸发酵中应用很广泛。抗生素与氨基酸发酵中流加的葡萄糖浓度一般在550mg/mL左右。高于550mg/mL的浓度，葡萄糖会结晶出来，堵塞流加管道。当流加糖浓度过低时，发酵醪液稀释过大，产物浓度过低。

我国古龙酸发酵生产的最大特点，是利用混菌发酵的方式来完成。大菌一般使用巨大芽孢杆菌，小菌一般使用氧化葡萄糖酸杆菌。对古龙酸发酵的研究表明，糖酸转化率主要与大、小菌的活力，培养基的成分有密切关系，基本上研究的方向主要集中于大、小菌的搭配，大、小菌菌形转化的时间和培养基成分上。而对于流加碳源的浓度对发酵产酸的影响几乎没有涉及。然而，当山梨糖对古龙酸的转化率一定，小菌的产酸速率一定时，流加糖的浓度从250mg/mL提高到500mg/mL时，流加体积将减少一半，发酵醪液的产酸将提高20～40％。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用浓缩山梨糖发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，首先对山梨糖发酵醪液进行浓缩，使醪液中山梨糖浓度达到500-550mg/mL，然后将其作为碳源流加于2-酮基-L-古龙酸的发酵过程中。

其中，所述山梨糖发酵醪液的制备方法为：向山梨糖的发酵培养基中接入黑醋菌，于37℃发酵培养28～38小时，山梨糖终浓度为240～330mg/mL。

所述山梨糖的发酵培养基配方为：山梨醇250～350mg/mL、玉米浆1.5～2.5mg/mL、酵母膏0.3～0.4mg/mL、碳酸钙0.6～0.8mg/mL，以水配制，pH值自然。

优选地，所述山梨糖的发酵培养基配方为：山梨醇260mg/mL、玉米浆2mg/mL、酵母膏0.3mg/mL、碳酸钙0.7mg/mL，以水配制，pH值自然。

浓缩采用多效浓缩工艺，可选择双效浓缩、三效浓缩、四效浓缩，优选双效浓缩、三效浓缩；更优选双效浓缩。双效浓缩工艺具体为：先将山梨糖发酵醪液于75-80℃，真空度0.04-0.05MPa条件下浓缩15-25分钟；然后于55-60℃，真空度0.08-0.095MPa条件下继续浓缩15-25分钟。

优选地，双效浓缩工艺具体为：先将山梨糖发酵醪液于78℃，真空度0.045MPa条件下浓缩20分钟；然后于58℃，真空度0.09MPa条件下继续浓缩20分钟。

前述方法还包括在浓缩前对山梨糖发酵醪液进行膜过滤的步骤，使用的微滤膜孔径大小为0.01-0.2μm。微滤膜的主要作用是去除山梨糖发酵结束后醪液中黑醋菌的菌体，以防止在二效浓缩过程中出现美拉德反应，导致料液色泽加深，给古龙酸提取工艺带来不利影响。优选的，微滤膜孔径大小选择0.05μm.。

前述方法中，向2-酮基-L-古龙酸的发酵培养基中按30v/v％的接种量接入巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌，并流加山梨糖发酵醪液，流加过程控制糖含量为20-22mg/mL；起始温度为29℃，30小时后，温度升至30℃，36小时后，温度升至31℃，培养40～50小时，发酵培养过程中，控制发酵体系pH值为6.7-6.8。

所述2-酮基-L-古龙酸的发酵培养基的配方为：山梨糖25mg/mL、酵母膏1mg/mL、玉米浆8mg/mL、尿素2mg/mL、硫酸镁0.6mg/mL、碳酸钙6mg/mL，以水配制。

前述方法中，通过向发酵体系中加入碳酸钠来控制发酵体系的pH值。