[发明专利]不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用

权利要求书

1.一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记的引物组合物，其特征在于其标记引物为BrSS15：

正向引物：5’- CCATTCGCGAGGTTAGATTC -3’，

反向引物：5’- ACACAGCCACATCAAACCAA -3’。

2.权利要求1所述的不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记的引物组合物在不结球白菜自交不亲和基因鉴定方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：通过PCR扩增

从育种分离世代材料中提取的DNA，如果能够扩增出240 bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于PCR反应体系为：每10微升体系中，40ng ·µL^-1 DNA模板0.5 µL，10×PCR buffer 1 µL，Mg^2＋ 0.8µL，2.5 mmol·L^-1 dNTPs 0.8 µL，100 ng ·µL^-1的正/反向引物各0.5 µL， 2.5 U·µL ^-1的Taq酶0.1 µl，ddH₂O 5.8µl；PCR扩增反应程序为：95℃预变性2 min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10 min；

采用改良的CTAB法从育种分离世代材料中提取DNA，其步骤为：配制CTAB缓冲液，每100 mL中含有：CTAB 2g，pH 8.0的Tris –HCl 0.1 mol·L^-1，pH 8.0的EDTA-Na₂20 mmol·L^-1，NaCl 1.4 mol·L^-1，PVP 2g，dd H₂O 29g；将2%的CTAB提取缓冲液于65 ℃提前预热并按体积比加β-巯基乙醇；将0.1 g待提取DNA的幼嫩叶片研磨成细粉末状，加入1mL CTAB提取缓冲液，迅速转移至离心管；65 ℃水浴70 min，期间每15 min取出摇匀；12000 rpm离心5min，取上清，加1mL氯仿/异戊醇轻摇，12000 rpm离心10 min，重复一次；取1mL预冷异丙醇，将上清液缓慢加入，-20℃静置2-3 小时；12000 rpm离心10 min，加70%乙醇1 mL，12000 rpm离心5 min，重复一次；风干，加入50~100 µL含RNase的ddH₂O溶解DNA，用1%的琼脂糖电泳检测，-20℃保存备用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，包括预电泳、上样和电泳步骤；电泳后使用银染法进行凝胶染色，染色步骤如下：将凝胶放入由10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液配置而成的固定液中，放在摇床上轻摇12-20 min，直至胶面指示剂颜色褪掉；用0.2% AgNO₃溶液染色12-20min，用去离子水漂洗2次；在显色液中显色至条带清晰为止，然后拍照保存。