[发明专利]一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体的说，涉及一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶及其应用。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，也称为三酰基甘油酰基水解酶，能够催化甘油三酯水解，生成的产物包括甘油二酯、甘油单酯、脂肪酸和甘油。偏甘油酯脂肪酶是指对酰基甘油碳链数量具有催化选择性的一类脂肪酶，它们对甘油三酯并没有催化水解活力，仅对甘油二酯和/或甘油单酯具有活力。偏甘油酯脂肪酶主要有两类：甘油单酯-甘油二酯脂肪酶和甘油单酯脂肪酶。偏甘油酯脂肪酶在饲料添加剂、食品与营养，农业、日用化学工业都展现出诱人的应用前景。在油脂加工领域，偏甘油酯脂肪酶可用于制备高纯度的甘油酯产品。因此，新型偏甘油酯脂肪酶的开发为高效制备甘油二酯和开发高纯度的甘油二酯生产工艺提供现实意义。

目前已知微生物来源的偏甘油酯脂肪酶非常有限。另外，国内开发的脂肪酶的酶学性质并不能适应新的使用需求。目前使用的脂肪酶大多都是中温酶(其最适温度基本都在50℃左右)，而在食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等领域中，却需要低温脂肪酶的参与来进行。因此，开发低温酶获得新型有工业价值的偏甘油酯脂肪酶有潜在的需要。利用生活在高盐度、高压、低营养和低温等的所谓生命极限环境下的微生物，筛选新型低温酶成为寻找符合工业化要求的脂肪酶的主要途径之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种对偏甘油酯水解活性高的海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶，可以应用于选择性去除油脂产品中的偏甘油酯，以使其满足工业上的需要。

本发明的第一个方面公开了一种来自海洋微生物的新型偏甘油酯脂肪酶。

本发明的另一个方面，提供了一种编码上述脂肪酶的优化的核酸分子，获得在毕赤酵母高表达的偏甘油酯脂肪酶。

本发明的第三个方面，提供了一种载体，其包含上述多核苷酸。

本发明的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有上述多核苷酸。

本发明的第五个方面，提供了上述脂肪酶的用途，用于催化偏甘油酯水解反应。

本发明的第六个方面，提供了一种生产上述脂肪酶的方法。

本发明的技术方案具体如下：

一种海洋微生物来源的低温偏甘油酯脂肪酶，该酶是对两面神菌(Janibacter sp.HTCC2649)偏甘油酯脂肪酶基因序列进行优化得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种偏甘油酯脂肪酶基因，序列如SEQ ID NO:1所示。

一种包含上述基因的表达载体。

一种细胞，包含上述表达载体，或其基因组中整合有上述脂肪酶基因。

一种生产上述脂肪酶的方法，包括：培养上述细胞，从培养物中分离出表达产物。

一种偏甘油酯脂肪酶重组菌株的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备偏甘油酯脂肪酶表达质粒：

a.人工合成权利要求2的基因序列；

b.将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和SalI分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到脂肪酶表达质粒；

(2)利用表达质粒制备重组菌株：

a.将步骤(1)的脂肪酶表达质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；

b.将转化液涂布于含有100mg/ml Zeocin的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。

步骤(1)所述PCR的引物序列如下：

MAJ1 For5’-TACTGGTACCGCCACCGTCGCTGCTGATCCC-3’

MAJ1 Rev5’-AGCTCTCGAGTCAGTGATGGTGGTGATGGTG-3’。

步骤(2)所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33(Pichia pastoris)。

上述脂肪酶用于催化甘油酯的水解或合成甘油二酯，或用于植物油精炼过程中的酶法脱胶。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明获得中性脂肪酶，在pH7.0具有最适酶活性，其对橄榄油的水解反应中，最适温度为40℃；对大豆卵磷脂为底物的水解反应中，最适反应温度为30℃。同时该脂肪酶在20℃～30℃处理3小时仍然具有大于95％的酶相对剩余活性。因此，可以通过温度来调节其脂肪酶和磷脂酶活性。