[发明专利]一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组伪狂犬病病毒，其特征在于：其是以重组伪狂犬病病毒PRV/TK^-/gE-/EGFP⁺为母本，将含猪圆环病毒2型的主要免疫原性基因ORF2的表达盒替换插入gE基因中的EGFP基因表达盒获得的重组伪狂犬病病毒，即rPRV-ORF2；该病毒保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC-V201408。 

2.一种如权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒的构建方法，其特征在于：其步骤如下： 

1)pgE-ORF2的构建：设计ORF2扩增引物，以PCV2阳性病料中提取的PCV2DNA为模板，经PCR扩增获得ORF2全基因，经KpnI与XhoI消化后，克隆至pUC19-gE/EGFP替换EGFP获得pgE-ORF2； 

2)转染：在细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞80％融合时以PRV/TK^-/gE-/EGFP⁺感染BHK-21细胞后，再以pgE-ORF2转染；转染后，继续培养60h～72h，冻融收获病毒； 

3)纯化与鉴定：将转染后收获的病毒接种于细胞培养板中80％融合细胞后培养至明显病变出现，挑选无荧光噬斑，并纯化至100％无荧光，获得一种重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-ORF2。 

3.如权利要求1所述的重组伪狂犬病病毒在制备猪伪狂犬病与猪圆环病毒2型疫苗中的应用。 

4.一种重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于：其包括如权利要求1所述rPRV-ORF2病毒液和保护剂/佐剂。 

5.根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于：所述的rPRV-ORF2的TCID₅₀为10^5-7/0.1ml。 

6.根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于：所述保护 剂为rPRV-ORF2病毒液和保护剂的体积比为1:1。 

7.根据权利要求4所述的重组伪狂犬病病毒疫苗，其特征在于：所述保护剂为由去离子水、蔗糖、明胶组成，其中每100ml保护剂中蔗糖30-50g，明胶5-10g。