[发明专利]一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体和应用。

背景技术

血栓是指血液成分在血液流动过程中，在血管或心脏内膜表面形成的一种半凝块状物质。血栓由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。在临床上常见到血栓性疾病，如冠脉综合征、深静脉血栓等。血栓性疾病属于心脑血管疾病，全球每年因心脑血管疾病死亡人数达1200万，相当于世界总死亡人数的1/4，已成为人类生命的头号杀手。

弥散性血管内凝血(DIC)又称消耗性凝血病、去纤维蛋白综合征。DIC是一种影响中枢神经系统最为常见和严重的凝血疾病。常见病因有严重感染、创伤、产科和血管病急症、癌症、非细菌性血栓性心脑膜炎、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤、脑血管畸形，心、肝、肾功能衰竭和免疫性疾病等。在各种致病因素的作用下，血循环内出现局限的或弥漫性的凝血促动，凝血瀑布被激活，产生过量的凝血酶。凝血系统进一步被激活，使血液凝固性增高，破坏了体内凝血和抗凝过程的平衡，易引起脑组织缺血、缺氧和缺血性梗死。

针对血栓和DIC两种疾病，国内外已经研究和开发了很多药物。主要包括两大类药物，如抗凝血药物肝素、华法林、Fondaparinux、水蛭素等，以及抗血小板药物磷酸二酯酶抑制剂、阿西匹林、ADP受体抑制剂、GPIIb/IIIa受体抑制剂等。以上药物的缺陷在于它们的作用只限于单一靶点。而蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族成员可以调控不同底物蛋白的二硫键状态，能作用于多个靶点。但是，目前鲜有针对蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族成员用于预防和治疗血栓性疾病和弥散性血管内凝血的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗一种杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体，使所产生的单克隆抗体具有防治血栓形成和抑制凝血酶的作用，可以应用于治疗血栓性疾病和如弥散性血管内凝血这种凝血性疾病的药物制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC NO.9153。

本发明所述单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠，3天后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞按照5∶1～10∶1的比例混合，利用PEG进行细胞融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体，获得所述单克隆抗体杂交瘤细胞。

其中，所述SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白免疫BALB/C小鼠具体为：

取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次皮下注射，21天后取SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白300μg加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次皮下注射，10天后尾部采血并用ELISA间接法测定抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白的鼠血清效价，选择效价高的BALB/C小鼠用SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白100μg进行免疫。

本发明所用抗原蛋白选自蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族，通过优化编码基因表达所述抗原蛋白，以其实现所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体具有双向抑制性功能，其既可抑制血栓形成，也可抑制凝血反应。所述抗原蛋白可由试剂公司进行全合成，或参照SEQ ID NO:2所示核苷酸序列进行常规表达获得。

经过上述方法制备后，最终筛选出能够稳定分泌抗SEQ ID NO:1 所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为DuIn，并于2014年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.9153。

此外，本发明还提供一种抗SEQ ID NO:1所示氨基酸序列蛋白单克隆抗体(以下简称DuIn抗体)，由保藏编号为CGMCC NO.9153的杂交瘤细胞分泌产生。

制备DuIn抗体可采用本技术领域常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水，本发明优选为：