[发明专利]一种苯乙醛还原酶突变体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用作生物催化剂催化手性醇合成的苯乙醛还原酶(Phenyacetaldehyde Reductase,PAR)突变体。

背景技术

手性醇(Chiral Alcohols)是一类重要的合成中间体，其广泛应用于精细化学、农药、液晶材料的合成，尤其是手性药物的合成。以手性α-氯代芳香醇为例，单一光学活性的手性α-氯代芳香醇已被用于合成一系列具有生物活性的药物，如抗抑郁药物、抗糖尿病药物、β肾上腺受体激动剂等。

利用羰基还原酶催化前手性酮羰基的不对称还原是制备手性醇的常见方法，该方法因高效率、高立体选择性、反应条件温和、环保等优点而受到广泛的关注。然而，由于在应用过程中的底物通常和天然底物具有较大差异，大部分的醛酮羰基还原酶底物谱比较窄或催化一些重要手性醇合成的活力较低。以苯乙醛还原酶为例，其催化苯乙酮还原的活力仅为催化苯乙醛还原的35％(Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(10):3783-3788)。较低的催化活性会降低反应的速度、产率和最终产量，同时随着反应时间的延长酶的活性会进一步降低甚至失活。

利用定点突变等蛋白质工程技术是对酶进行改造从而获得性质改善的突变体的有效手段。对酶的改造一般使用两种手段，一种是进行随机突变的定向进化，另一种是进行定点突变的理性改造。定向进化是在没有足够的酶的结构和功能信息的情况下对酶进行随机的突变建立突变体库，然后通过大规模的筛选得到性质改善的突变体。例如Andre等对来源于Candida parapsilosis的羰基还原酶亚基间相互作用区域的几个环区进行了随机突变，通过筛选得到的含A275S/L276Q双点突变的突变体活力为野生型的1.4倍(J.Biotechnol.,2013,165(1):52-62)。理性改造则是在结构与功能的关系的基础上，对能够影响功能的关键位点进行定点突变，从而实现精确的改造。如在Karla等对来源于Thermoanaerobacter ethanolicus的醇脱氢还原酶(TeSADH)结构模型的基础上进行了定点突变，得到的W110A突变体能够催化芳香酮的不对称还原生成相应的手性醇，而野生型的TeSADH不能催化芳香酮的还原(Protein Eng.,Des.Sel.,2007,20(2):47-55)。

尽管酶改造在提高羰基还原酶酶活力方面取得了一些进步，但目前成功的例子并不多，尤其是通过定点突变的理性改造。随着越来越多的羰基还原酶晶体结构的解析，基于结构和功能的理性改造将会继续是手性醇生物不对称合成领域的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种催化活性提高的苯乙醛还原酶突变体，其氨基酸序列如其氨基酸序列如SEQ ID NO:4、6或8所示。

上述苯乙醛还原酶突变体为苯乙醛还原酶的氨基酸发生如下任意一种情况的突变：

(1)苯乙醛还原酶的氨基酸序列中第102位亮氨酸突变为苯丙氨酸；

(2)苯乙醛还原酶的氨基酸序列中第102位亮氨酸突变为精氨酸；

(3)苯乙醛还原酶的氨基酸序列中第102位亮氨酸突变为谷氨酸；

其中，所述的苯乙醛还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，基因序列如SEQ ID NO：1所示。

上述的苯乙醛还原酶突变体可作为催化剂用于手性化合物的合成，所述手性化合物优选(R)-α-氯代苯乙醇或(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

本发明还提供了编码上述苯乙醛还原酶突变体的基因，其核苷酸序列序列如SEQ IDNO:3、5或7所示。

本发明还提供了一种构建上述苯乙醛还原酶突变体的基因工程菌的方法，具体包括如下步骤：

1)采用化学合成或PCR方法获得编码所述苯乙醛还原酶突变体的基因；

2)将步骤1)获得的苯乙醛还原酶突变体基因连接至原核表达载体，得到重组表达载体，本发明中采用了的表达载体为pET-22b(+)，也可选用……。

3)将步骤2)获得的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)得到基因工程菌。