[发明专利]一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△ xpf （简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf），该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO ：M 2013403，保藏日期为2013年9 月10日。

2.一种权利要求1所述的敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对质粒T2（2）-ori进行双酶切，得到线性的T2（2）-ori质粒；（2）以原始地衣芽孢杆菌DW2（简称：Bacillus licheniformis DW2）的基因组DNA为模板，分别以上、下游同源臂引物进行PCR扩增，分别得到上、下游同源臂；（3）以上、下游同源臂共同作为模板进行soe-PCR，得到上、下游同源臂融合DNA片段；（4）采用DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对上、下游同源臂融合DNA片段进行双酶切，并将酶切后的上、下游同源臂融合基因片段与线性的T2（2）-ori质粒连接，得到已敲除xpf基因的质粒T2（2）-ori-xpf；（5）将质粒T2（2）-ori-xpf转入原始地衣芽孢杆菌DW2，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到成功转化的地衣芽孢杆菌 (T2（2）-ori-xpf) [简称：Bacillus licheniformis (T2（2）-ori-xpf)]；（6）将Bacillus licheniformis (T2（2）-ori-xpf)经过45℃和卡那霉素抗性筛选得到上游臂或下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株；（7）单交换菌株再通过卡那霉素抗性筛选得到敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf （简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf）。

3.一种权利要求1所述的敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其应用于抗菌肽生产，应用步骤为：

A菌种活化，菌种活化培养基配方为（g/L）：酵母粉3~7、蛋白胨8~12、NaCl 9~13，pH 7.0-7.4，培养条件为将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌DW2△ xpf以体积百分比1%接种于装有5~8ml 菌种活化培养基的PA瓶中，180～300rpm，33~37℃，10～14h，得到含有地衣芽孢杆菌DW2△xpf的菌液；

B摇瓶发酵，摇瓶发酵培养基配方为（g/L）：豆粕 8~12%、玉米淀粉 4~5%、CaCO₃ 0.5~0.8%、(NH₄)₂SO₄  0.08~0.13%；向三角瓶中加入20~40 mL的摇瓶发酵培养基，将步骤A的含有地衣芽孢杆菌DW2△xpf的菌液以体积百分比2~5% 接种于三角瓶内的摇瓶发酵培养基中，150~200r/min，33~37℃培养46~48 h，得到发酵液。