[发明专利]一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种敲除缺陷型原噬菌体(简称：PBSX)的正调控因子基因xpf的地衣芽孢杆菌菌株，并将其应用于抗菌肽生产中。 

背景技术

杆菌肽为淡黄色或类白色粉末，无嗅，味苦，是由10种氨基酸、12个氨基酸残基构成的多肽类抗生素，可有效抑制革兰氏阳性病原菌和部分革兰氏阴性菌。杆菌肽通过组氨酸的咪唑基和噻唑环，与多种金属离子如Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺和Mn²⁺等生成络合物，其中以锌盐形式存在的杆菌肽，抑菌活性得到一定程度的增强，且稳定性最好。杆菌肽具有在肠道内几乎不吸收，排泄迅速，体内不残留等优点，因此被广泛添加于饲料中。 

目前，杆菌肽一般通过微生物发酵法生产，其中，杆菌肽的主要生产菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。但是，由于此两种生产菌株中均被发现存在缺陷型原噬菌体PBSX，在正常情况下，PBSX的编码基因整合在宿主细胞基因组上，并随着宿主细胞基因组一同复制；当宿主细胞受到SOS刺激诱导(例如丝裂霉素C的诱导时)，PBSX便会在宿主细胞中大量合成，并通过裂解宿主细胞而释放到胞外，导致宿主细胞数量的大幅减少(即发酵过程中菌株细胞量下降)，从而影响杆菌肽的产量。 

发明内容

本发明旨在提供一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法，此菌株不仅可产生抗菌肽，并且，不会被PBSX所裂解，因此，将此菌 株在抗菌肽生产中应用可实现高产抗菌肽的目的。 

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌DW2△xpf(简称为：Bacillus licheniformis DW2△xpf)，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013403，保藏日期为2013年9月10日。此菌株不仅可产生抗菌肽，并且，不会被PBSX所裂解。 

一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)采用限制性DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到线性的T2(2)-ori质粒；(2)以原始地衣芽孢杆菌DW2(简称：Bacillus licheniformis DW2)的基因组DNA为模板，分别以上、下游同源臂引物进行PCR扩增，分别得到上、下游同源臂；(3)以上、下游同源臂共同作为模板进行soe-PCR，得到上、下游同源臂融合DNA片段；(4)采用DNA内切酶XbaⅠ和SacⅠ对上、下游同源臂融合DNA片段进行双酶切，并将酶切后的上、下游同源臂融合基因片段与线性的T2(2)-ori质粒连接，得到已敲除xpf基因的质粒T2(2)-ori-xpf；(5)将质粒T2(2)-ori-xpf转入原始地衣芽孢杆菌DW2，以卡那霉素抗性作为筛选标记，筛选得到成功转化的地衣芽孢杆菌(T2(2)-ori-xpf)[简称：Bacillus licheniformis(T2(2)-ori-xpf)]；(6)将Bacillus licheniformis(T2(2)-ori-xpf)经过45℃和卡那霉素抗性筛选得到上游臂或下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的单交换菌株；(7)单交换菌株再通过卡那霉素抗性筛选得到敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf(简称：Bacillus licheniformis DW2△xpf)。在地衣芽孢杆菌DW2中通过在质粒T2(2)-ori上连接xpf基因的上下游敲除同源臂，构建了一种能对xpf基因进行无痕敲除的质 粒，并通过高温和抗生素筛选成功实现了xpf基因的无痕敲除，从而成功获得了敲除xpf基因的地衣芽孢杆菌DW2△xpf。 

所述原始地衣芽孢杆菌(简称：Bacillus licheniformis DW2)，该菌株保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011344，保藏日期为2011年10月12日。 

本发明的敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株的应用，其应用于抗菌肽生产，应用步骤为：