[发明专利]从玉米浆中提取生物素的方法及其薄层层析扫描检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从玉米浆中提取生物素的方法，以及生物素的薄层层析扫描检测方法。

背景技术

生物素是生命活动中必需的维生素之一，是机体内许多酶的辅助因子，参加机体的羧化、脱羧和脱氢反应，参与糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢。生物素已广泛应用于食品、化工、医药、畜牧、生物发酵等领域。在谷氨酸发酵生产中，生物素用量的控制直接影响着生产菌的生长、增殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性以及谷氨酸产酸率的高低，由于大多数谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量对生产起着至关重要的作用，因此开展对生物素检测的研究具有重要的意义。

在玉米淀粉制造工艺中，玉米粒首先要经亚硫酸稀液浸泡。该浸泡液即为玉米浆，其中生物素的含量丰富，可作为良好的谷氨酸发酵的原料和添加物，是目前谷氨酸生产中生物素的主要来源之一。但由于其中生物素的含量与玉米的来源、生产批次等密切相关，因此，为稳定生产、提高产酸率必须准确测定其中的生物素含量，才可在谷氨酸发酵中实现生物素用量的准确控制。

目前文献报道的生物素的检测方法有微生物法、荧光法、分光光度法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法等等。对玉米浆中生物素的检测，微生物法最为常用。微生物法由于大多数菌株都不是专一性的，因此会带来较大的检测误差，并且整个操作过程费时、费力。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种操作简单、可靠的以玉米浆为原料提取生物素的方法，及对提取生物素进行检测的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种从玉米浆中提取生物素的方法，步骤如下：

(1)取玉米浆，加入1～2倍(体积倍数)的N,N-二甲基甲酰胺，加热提取，提取温度为75℃～85℃，提取时间为1～2h，提取后过滤，得提取液和滤渣；用无水乙醇洗涤滤渣3～5次，过滤，合并滤液得乙醇洗涤液，每次无水乙醇的用量与玉米浆的体积相等；将提取液和乙醇洗涤液合并，过滤，滤液经旋转蒸发仪蒸发浓缩至玉米浆体积的8/10～6/10，得浓缩液；

(2)向步骤(1)所得浓缩液中加入3倍(体积倍数)的无水乙醇，静置，过滤除去沉淀，滤液再次用旋转蒸发仪蒸发浓缩至玉米浆体积的4/10～3/10，得浓缩液；

(3)向步骤(2)所得浓缩液中加入4～5倍(体积倍数)的丙酮，静置，过滤除去沉淀，滤液再用旋转蒸发仪蒸发浓缩至玉米浆体积的2/10，得浓缩液；

(4)向步骤(3)所得浓缩液中加入3～4倍(体积倍数)的丙酮，静置，过滤除去沉淀，蒸发浓缩至玉米浆体积的1/20，得浓缩液；

(5)步骤(4)所得浓缩液中加入乙酸丁酯和环己烷，乙酸丁酯、环己烷的加入量与浓缩液的体积相同，静置分层；取上清液，即为生物素溶液(含有生物素的溶液)。

以上方法中，旋转蒸发的温度为40～60℃。

一种生物素的薄层层析扫描检测方法，步骤如下：

(1)取待检测样品液(即上述方法制备得到的上清液)4μl，点在涂有硅胶GF254高效薄层板(10cm×10cm)上，向展开缸加入展开剂，在展开缸(10cm×12cm×15cm)内展开，展开剂的饱和时间为60分钟，展开距离为6cm，展开时间为15分钟，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点4μl不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开；

所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为3:3:2:0.06；

所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列标准品溶液；

所述生物素标准品溶液的配制方法为：精密称取生物素标准品(购自Sigma公司)1.29mg,加入N,N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为1mg/ml的标准溶液；精密吸取50，200，250，300，400μl1mg/ml的标准溶液，配制成浓度分别0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列标准品溶液；

(2)将2,4-二甲氨基肉桂醛、硫酸和无水乙醇混合，配成染色液，其中2,4-二甲氨基肉桂醛终浓度为0.1～0.2％(质量体积分数，单位g/ml)，硫酸终浓度为1～2％(质量体积分数，单位g/ml)；展完后晾干的展板，用染色液喷雾染色，得到与背景对比明显的标准品的斑点和样品的斑点(橙红色)；