[发明专利]一种毛蚶多糖的含量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及药品检测方法，具体涉及一种毛蚶多糖的含量测定方法，属药品技术领域。

背景技术

毛蚶肉含丰富的蛋白质、维生素及蛋白质、多糖，自古就有着食用、药用价值，《医林纂要》注“蚶肉补心血、散瘀血、除烦醒酒、破结消痰”，《日华子本草》注“蚶肉益血色”。近年来，研究报道显示毛蚶有抗肿瘤作用，具有清除体内自由基、提高机体免疫力的功效，且安全性良好。

根据文献报道毛蚶多糖是毛蚶的主要生物活性成分之一，具有抗肿瘤、调节免疫的功效。中国药科大学博士生导师沈于龙教授报道，从毛蚶体内分离纯化得到毛蚶多糖精品，能够显著的促进脾淋巴细胞的增殖，具有显著的体外免疫活性。

多糖是生命活动的基本物质，所有动植物生命体都含有多糖，在无法确定多糖来源的情况下，就不能保证药品的有效性，不能准确测定多糖的含量，就无法在生产和使用中保证产品质量，进而药品疗效得不到保证。

现有文献还没有毛蚶多糖专属性和含量测定的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种毛蚶多糖的含量测定方法，使毛蚶制剂在生产和使用中有效的保证产品质量。

一种毛蚶多糖的含量测定方法，其特征在于先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中的多糖是毛蚶多糖，再用分光光度法测定含量，具体步骤如下：

（1）色谱条件及系统适应性：用亲水球形高聚物为填充剂的凝胶色谱柱；以0.1mol/L的硫酸钠溶液为流动相；示差折光检测器；柱温：40℃；流速：0.5ml /min；理论板数按葡萄糖峰计算应不低于5000；

（2）称取含毛蚶提取物约2g的样品，加15倍的石油醚：乙醇=1：1的溶液，于40℃水浴保温3hr，超声提取30min，脱脂棉过滤，取滤渣，挥干；加去离子水20ml，用氢氧化钠溶液调pH至7.5～8，80℃水浴3hr，时时搅拌，过滤，滤液另器保存，滤渣加去离子水20ml，继续水浴2hr，时时搅拌，过滤，滤液合并，加3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心，沉淀加去离子水20ml ，80℃水浴2hr，离心，取上清液；加1/4体积的氯仿:正丁醇=4:1的溶液，剧烈振摇，离心，取上层液体，重复操作多次，至液面中间蛋白层完全消失，取上层液体，加入3倍量乙醇沉淀6hr以上，弃上清液，下层液离心离心，取沉淀，80℃以下减压干燥，制得毛蚶多糖。取毛蚶多糖，加流动相使溶解，制成每1ml含10mg的溶液，即得；

（3）取毛蚶多糖供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定记录图谱；图谱中如果以图谱中的S峰为参照，呈现2个特征峰，且以S峰为1，2个特征峰的相对保留时间在峰1为0.56±10%、峰2为0.68±10%，其重均分子量（Mw）在6.88～9.47×105之间，则继续进行以下操作，如无则判为伪品；

（4）称取含毛蚶提取物约1-4g样品，精密称定，置圆底烧瓶中，加30-50倍水，加热回流1-3小时，用脱脂棉滤过，滤液移至50-150ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1-5ml，加5-10倍乙醇，搅拌，离心5-20分钟，沉淀加水溶解，置20-50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1-5ml，加1/2体积的4%苯酚溶液，混匀，迅速加入硫酸5-10ml，摇匀，于30-50℃水浴中保温20-60分钟，取出，置冰水浴中2-10分钟，取出，即得毛蚶多糖供试品。取毛蚶多糖供试品溶液以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在488nm的波长处测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的重量(mg)，计算含量。我们经过反复试验发现，制剂中每g毛蚶提取物含毛蚶多糖以葡萄糖(C6H12O6)计，不得少于24mg，含量越高，疗效更好。

毛蚶提取物经真空干燥后的样品多糖含量为13%，在毛蚶制剂化学成分研究中，我们发现，多糖的活性与去相对分子量质量有关，相对分子质量越大，则分子体积越大，不利于多糖发挥生物活性，小分子量的多糖为主要活性成分。而大分子量的魁蚶、泥蚶、花蛤、扇贝提取物，其所含的多糖分子量不同于毛蚶多糖，用凝胶色谱柱高效液相色谱法测定，在相对保留时间0.56±10%和0.68±10%无毛蚶多糖特征峰，因此用本发明的方法测定毛蚶多糖的含量专属性强，能够保证用毛蚶制备的药品有效和质量可控。

为了便于理解本发明，特通过下面试验例进一步说明：

一、两批毛蚶提取物