[发明专利]一种植物DNA的快速提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种植物DNA的快速提取方法。

背景技术

通常棉花的DNA提取方法为水浴提取法，步骤基本是这样：粉碎样品；加恒温65℃裂解液在65℃下水浴30-40分钟，充分裂解细胞膜和核膜，使DNA从细胞中释放出来；然后加苯酚或氯仿去蛋白、酚类物质和多糖等，离心；取上清，用异丙醇沉淀DNA。

子叶DNA提取的主要步骤如下：1)取发芽1周的子叶一片装于2ml的离心管中，同时装入一粒钢珠，保存于-70℃低温冰箱中备用。提取时用研磨仪进行冷冻研磨，一般磨2次，每次20秒。2)研磨后取出钢珠，加入提取液700μl，摇匀，放入65℃水浴40分钟，中间每10分钟缓慢颠倒离心管(提取液的组成：0.1M Tris-HCl、0.025M EDTA钠盐、2％CTAB、2％pvp、1.5M NaCl、2％β-巯基乙醇)。3)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢颠倒8-10分钟，4℃条件下12000rpm离心10分钟。4)取上清液，加入0.6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静止2分钟，用移液器枪头把絮状物挑到离心管中。5)用70％的酒精洗2次，100％酒精洗1次，倒干酒精，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用(付小琼等.棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用.中国棉花学会2011年年会论文汇编.中国棉花学会2011年年会.中国棉花学会.2011-08-07)。

种子DNA提取的主要步骤如下：1)用电动种子粉碎机将去壳棉仁充分粉碎后转入2ml的离心管中。2)加入提取液700μl，摇匀，放入65℃水浴40分钟，中间每10分钟缓慢颠倒离心管(提取液的组成：0.1M Tris-HCl、0.025M EDTA钠盐、2％CTAB、2％pvp、1.5M NaCl、2％β-巯基乙醇、0.1g/L蛋白酶K)。3)水浴结束后，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀至不分层，4℃条件下12000rpm离心10分钟。4)取上清加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀至不分层，4℃条件下12000rpm离心通过10分钟。5)取上清液，加入0.6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静止2分钟，用移液器枪头把絮状物挑到离心管中。6)用70％的酒精洗1次，100％酒精洗一次，倒干酒精，在真空干燥机中干燥DNA。用500μl灭菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用(付小琼等.棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用.中国棉花学会2011年年会论文汇编.中国棉花学会2011年年会.中国棉花学会.2011-08-07)。

目前，在棉花DNA的提取过程中，耗时长，且需要65或60℃的水浴，经常影响到大量棉花品种纯度检测时的速度。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物DNA的快速提取方法，该方法与现有的植物DNA提取方法(水浴提取法)相比，不但缩短时间还简化了提取工艺。

本发明所提供的植物DNA的快速提取方法，简称冰浴法，包括下述步骤1)和2)：

1)破碎植物器官和/或组织，得到植物粉末；

2)向所述植物粉末中加入细胞裂解液和溶液S，在冰浴中反应15-40分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液1，除去所述提取液1的杂质，得到DNA；

上述植物DNA的快速提取方法中，所述细胞裂解液由水和溶质组成，所述溶质及其浓度为0.1M Tris-HCl、0.02M EDTA钠盐、2％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵、2％(质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮、1.5M NaCl和1％(体积百分含量)β-巯基乙醇；

上述DNA的快速提取方法中，所述溶液S为溶液A或溶液B；

上述DNA的快速提取方法中，所述溶液A由苯酚、氯仿和异戊醇组成，所述溶液A中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；

上述DNA的快速提取方法中，所述溶液B由氯仿和异戊醇组成，所述溶液B中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。

上述DNA的快速提取方法中，所述植物器官为种子，所述除去所述提取液1的杂质包括以下步骤：将所述提取液1进行离心，使DNA进入上清液中，收集上清液，将该上清液称为上清液A1，向所述上清液A1中加入所述溶液B反应3-5分钟，得到含有DNA的提取液，将该提取液称为提取液A2，除去所述提取液2的杂质，得到DNA。