[发明专利]以糖蜜为原料提取生物素的方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，以及生物素的检测方法。

背景技术

生物素是生命活动中必需的维生素之一，是机体内许多酶的辅助因子，参加机体的羧化、脱羧和脱氢反应，参与糖类、脂肪、蛋白质三大营养物质的代谢。生物素已广泛应用于食品、化工、医药、畜牧、生物发酵等领域。在谷氨酸发酵生产中，生物素用量的控制直接影响着生产菌的生长、增殖、代谢和细胞壁、细胞膜的渗透性以及谷氨酸产酸率的高低，由于大多数谷氨酸菌都是生物素缺陷型的，所以生物素的含量对生产起着至关重要的作用，因此开展对生物素检测的研究具有重要的意义。

糖蜜是一种粘稠、黑褐色、呈半流动态的物质，是制糖工业上不能再用来煮制糖品的废料，但糖蜜中生物素的含量丰富，可作为良好的谷氨酸发酵的原料和添加剂，是目前谷氨酸生产中生物素的主要来源。但由于其中生物素的含量与糖蜜的来源、生产批次等密切相关，因此，为稳定生产、提高产酸率必须密切关注糖蜜的组成变化，准确测定其中的生物素含量，以实现谷氨酸发酵中对生物素用量的控制。

现有技术文献报道的生物素的检测方法有微生物法、荧光法、分光光度法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法等等。目前，对糖蜜中生物素的检测，微生物法和高效液相色谱法最为常用，但存在以下缺陷：微生物法由于大多数菌株都不是专一性的，因此会带来较大的检测误差，并且整个操作过程费时、费力。高效液相色谱法投资大、溶剂用量大、成本较高，又由于糖蜜粘稠、色深、含有杂质较多，故样品处理即生物素的提取纯化过程困难，且高效液相色谱法对样品的纯度要求又较高，对成分复杂、色素含量高、杂质干扰大的糖蜜样品，不宜用该法检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种以糖蜜为原料提取生物素的方法，本发明还提供了一种生物素的薄层层析扫描检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

以糖蜜为原料提取生物素的方法，步骤如下：

(1)取糖蜜10～15g，加入100～150ml的80～95％(体积百分数)乙醇溶液于烧杯中，在40KHz，功率为300～500W，温度60～70℃条件下超声处理20～30分钟，此过程中糖蜜由液体变为块状；超声处理后，取出块状糖蜜，剩余乙醇溶液降温至5℃以下，过滤得残渣；将块状糖蜜与残渣合并，用100～150ml与超声处理同温度、同浓度的乙醇溶液冲洗过滤，得糖蜜渣块；

(2)将上述糖蜜渣块加入到100～150ml的95～100％(体积百分数)的乙醇溶液(当为100％时，为无水乙醇)中，在20KHz，300～500W，温度为55～65℃，超声探头深入液面下3cm，间隔5秒超声3分钟设置下连续超声20～30分钟，此过程中，糖蜜块已成黄土色粉状；超声处理后，趁热过滤，得滤液和滤渣，用45～55ml的55～65℃的95～100％(体积百分数)乙醇溶液洗滤渣，得洗液和滤渣，合并滤液和洗液得乙醇滤液，滤渣加入5～8ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌提取20分钟，过滤得DMF滤液；

(3)将乙醇滤液和DMF滤液合并，得生物素溶液(含有生物素的溶液)，旋转蒸发至2～3ml，作为下述检测的样品液。

一种生物素的薄层层析扫描检测方法，步骤如下：

(1)取待检测样品液(即上述方法制备得到的生物素溶液)4μl，点在硅胶板(优选10cm×10cm的涂有硅胶GF254高效薄层板)上，加入展开剂，在展开缸(10cm×12cm×15cm)内展开，展开剂的饱和时间为60分钟，展开距离为6cm，展开时间为15分钟，然后将薄层板拿出放在通风柜中晾干；同时，采用外标一点法点4μl不同浓度的生物素标准品溶液，同时展开；

所述展开剂为二氯甲烷-氯仿-甲醇-冰乙酸混合液，其中，二氯甲烷、氯仿、甲醇、冰乙酸四者的体积比为1～3:1～3:1～2:0.04～0.06，优选3:3:2:0.06；

所述生物素标准品溶液包括浓度分别为0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列标准品溶液；

所述生物素标准品溶液的配制方法为：精密称取生物素标准品(购自Sigma公司)1.29mg,加入N,N-二甲基甲酰胺1.29ml,配制成浓度为1mg/ml的标准溶液；精密吸取50，200，250，300，400μl1mg/ml的标准溶液，配制成浓度分别0.05μg/μl，0.2μg/μl，0.25μg/μl，0.3μg/μl，0.4μg/μl的一系列标准品溶液；