[发明专利]一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

质粒pBI-GFP的构建：利用BamHI和SacI内切酶切除pBI121载体中的GUS基因，同时在GFP两端加上BamHI和SacI酶切位点，再将GFP插入pBI121载体构建成pBI-GFP载体；

DNA片段Frt-GFP-Tnos的获得：以Frtm-HindIII-GFP(5'-TGCAAGCTTAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3’)和Tnos-HindIII-3’(5'-TGCAAGCTTCGATCTAGTAACATAGATGACACCG-3’)为一对引物，利用LA-Taq酶扩增pBI-GFP，由于引物Frtm-HindIII-GFP含有Frt位点，通过PCR将Frt位点加在GFP-Tnos之前，获得Frt-GFP-Tnos片段。Frtm代表了一种缩减的Frt位点，此位点只包含了核心序列，具有完整Frt位点的作用；

质粒pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos的构建：将DNA片段Frt-GFP-Tnos插入pBI121载体的HindIII位点，构建含有Frt特异性重组位点的表达载体T18，T18的结构为pBI-Frt-GFP-Tnos-35S-GUS-Tnos。

2.根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：

第一步：MS培养基配方：

以上溶液均配成100×的母液；

第二步：

筛选培养基：MS+3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+5mg/LAgNO3+400mg/LCar+13mg/L卡那霉素；

生根培养基：MS+0.2mg/LNAA+400mg/LCar+15mg/L卡那霉素；

YEB培养基：牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L)，蔗糖(5g/L)，MgSO₄(2mmol/L)pH7.2，固体培养基含琼脂15g/L；

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7.0，再补足水至1L，固体培养基含琼脂15g/L；

第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化；

第四步：DNA的连接；

第五步：连接产物的重组子鉴定。

3.根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，所述质粒DNA的酶切及其产物的纯化，包括以下步骤：

取上述质粒DNA1.0-2.0μg，加入相应酶的10×Buffer2.0μl，最后加入相应的限制性内切酶，混匀酶切反应体系，37℃酶切2-4小时；

在1％的琼脂糖凝胶上电泳，分离片段；

凝胶成像照相后，紫外光下切割目的片段，采用凝胶回收试剂盒回收目的片段；

取2μl在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检测回收目的片段大小和浓度。

4.根据权利要求1所述的一种只有35bpfrt位点序列的重组载体构建方法，其特征在于，所述DNA的连接，包括以下步骤：

按外源片段和载体比为1∶1-10∶1的量，加入相应量的片段。取回收的目的片段20-50ng，进行连接；

加入10×T₄LigationBuffer1.0μl，3UT₄DNALigase(Promega)，总体积不超过10μl；

连接反应程序：10℃3分钟；从10℃经历3分钟升至16℃；16℃3分钟；18℃1分钟；17个循环，后65℃5分钟灭活连接酶；

结束后将反应液取5μl至透析膜上加无菌水于4℃透析20分钟，取连接产物和20μl感受态细胞混合，进行电激转化。参数2KΩ，330μF，330-350V；

电激后将菌体转入1mlSOC中，37℃200rpm培养50分钟；后铺板于含抗生素的LB培养皿上。