[发明专利]一种只有35bpfrt位点序列的重组载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和转基因研究领域，可用于转基因的定向插入和多基因的定向叠加。更具体地讲，本发明涉及一种含有35bpfrt特异性重组位点的表达载体，同时涉及到含有frt特异性重组位点表达载体的构建方法，以及该发明在植物转基因和基因工程中的应用。

背景技术

酵母FLP/Frt位点特异性重组系统为双组份系统，FLP重组酶是酵母2μm质粒编码的特异性蛋白，可特异识别Frt位点DNA序列，Frt位点DNA序列包含长度为13bp的三个重复单元，其中一个重复单元是其它两个重复单元的反向重复，两个反向重复单元间有8bp的间隔序列，间隔序列的方向决定了Frt位点的方向(FutcherAB1988The2microncircleplasmidofSaccharomycescerevisiae.Yeast4：27-40.)。FLP重组酶可与Frt位点三个重复序列结合，并在间隔序列的边界切割DNA，引起同一DNA分子上两个Frt位点间的DNA片段发生倒位或剔除(SenecoffJF，BrucknerRC，CoxMM1985TheFLPrecombinaseoftheyeast2-micronplasmid：characterizationofitsrecombinationsite.Proc.Natl.Acad.Sci.82：7270-7274.；AndrewsBJ，ProteauGA，BeattyLG，SadowskiPD1985TheFLPrecombinaseofthe2microncircleDNAofyeast：interactionwithitstargetsequences.Cell40：795-803.)，或者引起不同DNA分子上的DNA片段在Frt位点发生整合(HuangLC，WoodEA，CoxMM1991Abacterialmodelsystemforchromosomaltargeting.NucleicAcidsRes19：443-448.)。

在植物基因组中，引入的FLP/Frt位点特异性重组系统已被证实同样能发挥其功能，这些功能已在水稻和玉米(LyznikLA，MitchellJC，HiyaramaL，HodgesTK1993ActivityofyeastFLPrecombinaseinmaizeandriceprotoplasts.NucleicAcidsRes21：969-975.)、烟草(LloydAM，DavisRW1994FunctionalexpressionoftheyeastFLP/FRTsite-specificrecombinationsysteminNicotianatabacum.MolGenGenet242：653-657.)、拟南芥(KilbyNJ，DaviesGJ，SnaithMR，MurrayJAH1995FLPrecombinaseintransgenicplants：constitutiveactivityinstablytransformedtobaccoandgenerationofmarkedcellclonesinArabidopsis.PlantJ8：637-652.)等植物中进行了广泛的验证。

为了提高植物转基因安全性，可利用FLP/Frt位点特异性重组系统删除植物基因组中的外源选择标记基因和报告基因。当两个Frt位点在同一DNA分子且方向相同时，FLP酶可将两个Frt位点间的基因删除。人们利用FLP/Frt重组系统已成功在烟草中删除了抗除草剂的乙酰乳酸合成酶als基因(单晓映，李蓓，张举仁2006利用FLP/frt重组系统产生无选择标记的转基因烟草植株.生物工程学报，22：744-750.)、删除了gus报告基因及发状根形成rolC基因(GidoniD，BarM，GilboaN2001FLP/FRT-mediatedrestorationofnormalphenotypesandclonalsectorsformationinrolCtransgenictobacco.TransgenicResearch10：317-328.)。