[发明专利]蟾饲五谷虫抗菌肽的医药用途

说明书

技术领域：

本发明属于医药技术领域，涉及蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及蟾饲五谷虫抗菌肽在制备抑菌剂中的应用。

背景技术：

蟾饲五谷虫是以蟾蜍科属中华大蟾蜍(Bufobufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蛛(B.melanostictus Schneider)等尸体为培养基质，人工培养的丽蝇科昆虫大头金蝇或其近缘昆虫的干燥幼虫。主产于华中、华东地区，我国各地区均有分布，一年四季均可采收。蟾饲五谷虫含蛋白质质量分数为62.70％、脂肪质量分数为11.20％、几丁聚糖质量分数为16％，氨基酸18种，含抗菌肽质量分数为0.264％。另外还含有华蟾蜍毒基和羟基华蟾蜍毒基等成分。

抗菌肽(antibacterial peptides)广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽(Prates MV,Sforca ML,Regis Wc,The NWR-derived solution structure of a new cationic antimicrobial peptides from the skin secretion of the anuran Hyla Punctana[J].J Biol Chem.2004,279(13):13018-13026.) 。抗菌肽广泛存在于动物的免疫细胞(如吞噬细胞)、各种脏器的粘膜、皮肤以及植物的花、果、叶中。抗菌肽也被称为生物的第二防御体系，家蝇抗菌肽的产生是由于外界环境的干扰，或者经过免疫诱导等方式，让家蝇体内产生一种免疫小分子即抗菌肽，但是免疫方式操作繁琐，工作量大。

不同的抗菌肽抑菌种类和抑菌效果往往不尽相同，因此可以采用不同的受试菌研究蟾饲五谷虫抗菌肽的抑菌结果，选择抑菌活性较强的受试菌，从而使其更有效地得以利用。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供蟾饲五谷虫抗菌肽的新用途，具体涉及其在制备抑菌剂中的应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。

其中，蟾饲五谷虫抗菌肽通过如下方法获得：

(1)提取

蟾饲五谷虫为沸水处理过的干燥虫体，称取50g两份，一份用磷酸盐缓冲溶液溶剂 (0.05mol/L的NaH2PO4 81.7ml与0.05mol/L Na2HPO4 12.3ml，调PH为6)处理，另一份用0.05mol/L乙酸铵溶剂(用乙酸调节PH为5)处理。样品干燥虫体和溶剂比为1：2，用匀浆机搅拌半个小时，放置一个晚上，样品液分别记号为1号和2号。放置过夜的样品，将 1号液采用低速离心机以5000r/min的速度离心15min，得上清液，除去大颗粒杂质，将上清液继续用0.22um的滤膜减压过滤，得到的滤液用高速离心机15000r/min的速度离心 30min,除去细胞器杂质等物质，滤液继续用0.22um的滤膜过滤的滤液，得到的1号澄清滤液。2号样品液仍然采用相同的处理方法。即得到2号澄清样品液。

(2)样品的除脂

以2号液磷酸盐缓冲溶液所提样品进行除脂处理，首先用相同体积的正己烷萃取12h,然后得到的水层采用相同体积的乙酸乙酯液离心。离心后得到的水层采用4摄氏度冰箱保存。

(3)样品的浓缩

盐析，是在蛋白质溶液中加入中性盐，破坏蛋白质的水化膜，而达到使蛋白质沉淀的作用，常用的中性盐有氯化钠，硫酸铵，由于硫酸铵在水溶液中溶解度大，且比较容易除去，所以我们采用硫酸铵盐析的方式。

实验中我们以80％的硫酸铵沉淀，慢慢的加入硫酸铵，防止局部过浓，引起蛋白质变性，1号和2号液均采取这样的方式处理，盐析半个小时。

(4)样品的再溶解

盐析过的1号和2号蛋白液，利用高速离心机，15000r/min离心15min,除去上清液，1号采用磷酸盐缓冲溶液溶解，2号采用乙酸铵缓冲溶液溶解，溶解液备用。

(5)样品溶液除菌

在无菌操作台下，用可以灭菌的0.22um的滤膜，用无菌的注射器，吸取1号和2号溶液，过滤膜，得到样品无菌液。

蟾饲五谷虫抗菌肽对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌，志贺杆菌具有抑制作用，尤其针对铜绿假单胞菌，甲型伤寒沙门杆菌，和肠炎沙门杆菌具有明显的抑制作用。

试验结果表明，蟾饲五谷虫抗菌肽可以用于制备抑菌剂。