[发明专利]一种表面展示PEDV核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法

权利要求书

1.一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，以α凝集素作为靶基因将COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，具体方法如下：

S1. pPICZ α A-COE-AGα重组质粒的制备：将凝集素AGα基因片段和pPICZ α载体通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ α A-AGα；将COE基因片段和重组质粒pPICZ α A-AGα通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ α A-COE-AGα；所述凝集素AGα基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO：1~2所示；

S2.采用电转化法将pPICZ α A-COE－AGα重组质粒导入毕赤酵母X33中，获得重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα。

2.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，S2所述电转化法为：取80μL毕赤酵母感受态细胞，与5～10μg线性化的重组质粒pPICZ α A-COE-AGα混合，冰浴15min，在电压1500V，电容量25μF，电阻200Ω条件下电击，电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇，30℃下孵育1～2小时，平板筛选高拷贝转化子。

3.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，凝集素AGα基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO：3~4所示，COE基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO：5~6所示。

4.权利要求1至3任一项所述方法制备得到的重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα。

5.权利要求4所述重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα在制备预防猪流行性腹泻口服疫苗中的应用。

6.一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.将重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα接种于YPD 液体中，30℃、250 r/min振荡培养过夜；再接种于BMGY体培养基中，30℃振荡培养24 h，至菌体OD_600nm达到2～6 时离心弃去上清，加入 BMMY 液体培养基，连续诱导培养72 h；

S2.离心去上清，将菌体用用悬浮缓冲液稀释得到细菌含量为 1×10¹⁰ CFU/mL的菌悬液，菌悬液再制备成口服疫苗，直接灌喂；所述悬浮缓冲液组成为：0.2 mol/L NaHCO₃，5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖悬浮。