[发明专利]一种表面展示PEDV核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物医药工程领域，特别是一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。

背景技术

自2010年10月份以来，仔猪腹泻病的发生与流行在国内主要养猪省份均呈持续上升趋势，也是引起7日龄以内仔猪死亡的重要原因，短短一年多，以广东省为首的南方10个省市仔猪死亡量超过了100万头，发病率为60%-100%，死亡率高达80%-100%，严重威胁着养猪业的健康发展，造成了巨大的经济损失。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是国内外学者较为认同的主要致病因素之一。目前防止猪病毒性腹泻的最为有效的手段是接种疫苗。虽然国内用于流行性腹泻的疫苗主要有：PEDV与TGEV二联疫苗（包括二联灭活苗及二联活疫苗）得到了广泛的推广和应用，在一定范围和程度上减少了病毒性腹泻的发病率，但仍然未能完全控制,尤其在2010年10月至今，该病呈持续性、爆发性增长趋势。从目前国内外对PEDV、TGEV和RV的研究结果及应用效果看，仔猪主要通过初乳获得母源sIgA，产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护，血清中的循环抗体IgG不能提供保护，经非肠道免疫不能产生母源免疫。因此，迫切需要研制出安全、有效、廉价并且可以诱导黏膜免疫的新型PEDV口服疫苗。

发明内容

本发明的目的在于为了克服现有技术中PEDV疫苗存在的上述缺陷，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法，以α凝集素作为靶基因将COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，具体方法如下：

S1. pPICZ α A-COE-AGα重组质粒的制备：将凝集素AGα基因片段和pPICZ α载体通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ α A-AGα；将COE基因片段和重组质粒pPICZ α A-AGα通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ α A-COE-AGα；所述凝集素AGα基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO：1~2所示；

S2.采用电转化法将pPICZ α A-COE－AGα重组质粒导入毕赤酵母X33中，获得重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα。

优选地，S2所述电转化法为：取80μL毕赤酵母感受态细胞，与5～10μg线性化的重组质粒pPICZ α A-COE-AGα混合，冰浴15min，在电压1500V，电容量25μF，电阻200Ω条件下电击，电击后立即加入1mL冰浴的1mol/L山梨糖醇，30℃下孵育1～2小时，平板筛选高拷贝转化子。

优选地，凝集素AGα基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO：3~4所示，COE基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO：5~6所示。

由以上方法制备得到的重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα。

所述重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα在制备预防猪流行性腹泻口服疫苗中的应用。

一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，包括如下步骤：

S1.将重组酵母Pichia pastoris X-33/pPICZ α A-COE-AGα接种于YPD 液体中，30℃、250 r/min振荡培养过夜；再接种于BMGY体培养基中，30℃振荡培养24 h，至菌体OD_600nm达到2～6 时离心弃去上清，加入 BMMY 液体培养基，连续诱导培养72 h；

S2.离心去上清，将菌体用用悬浮缓冲液稀释得到细菌含量为 1×10¹⁰ CFU/mL的菌悬液，菌悬液再制备成口服疫苗，直接灌喂；所述悬浮缓冲液组成为：0.2 mol/L NaHCO₃，5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖悬浮。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：