[发明专利]一种苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒

权利要求书

1.苹果病毒检测方法，其特征在于以巯基标记的DNA作为捕获探针，以荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者杂交形成双链DNA，双链DNA探针组装在纳米金颗粒上构建纳米金核酸探针，通过双链取代的方式检测植物病毒并对碱基突变序列进行区分。

2.如权利要求1所述的苹果病毒检测方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：

(1).以巯基标记的DNA作捕获探针、荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者在杂交缓冲液中杂交形成双链DNA溶液；

(2).步骤(1)制得的双链DNA溶液与纳米金溶液混合，双链DNA通过Au-S共价键连接至纳米金表面，制得纳米金核酸探针溶液；

(3).步骤(2)中制得的纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液混合，纳米金的终浓度为1-2nmol/L；

(4).将步骤(3)中所得混合液中添加人工合成苹果病毒寡核苷酸或待测苹果样本的RNA提取液，观察荧光现象。

3.如权利要求2所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述杂交缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2-7.5，并包括0.135-0.138mol/L的NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl；所述检测缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐溶液，其pH为7.2-7.5，并包括0.05-0.15mol/L的NaCl和0.5-1.5mmol/L的MgCl₂。

4.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述巯基标记的DNA捕获探针和荧光基团标记的DNA信号探针按1︰1.1—1：1.3的浓度比杂交。

5.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述巯基标记的DNA捕获探针，其巯基标记在3’端，包括21个核苷酸与靶序列互补的识别序列和9个腺嘌呤(A)；所述荧光基团标记的DNA探针，其荧光基团标记在5’端，包括10个核苷酸，与巯基标记的DNA探针的一部分完全互补，且互补碱基的部分从巯基标记的DNA探针的邻近9个连续A的第一个核苷酸开始；所述荧光基团为FAM羧基荧光素或花青染料Cy3。

6.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述双链DNA溶液与纳米金溶液按照298:1—302:1的浓度比合成纳米金核酸探针溶液，每个纳米金颗粒表面组装40-50个双链DNA分子，其包括30个巯基标记的DNA捕获探针和10个荧光基团标记的DNA信号探针。

7.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液按照1:2的体积比混合。

8.如权利要求2或3所述的苹果病毒检测方法，其特征在于所述纳米金的粒度为13-15nm，浓度为3nmol/L。

9.一种苹果病毒检测方法所使用的检测试剂盒，其特征在于包括上述方法制备的纳米金核酸探针溶液，盒内还设有检测缓冲液、人工合成苹果病毒寡核苷酸粉末。

10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于所述纳米金苹果病毒核酸探针溶液包括纳米金苹果茎沟病毒核酸探针溶液和纳米金苹果花叶病毒核酸探针溶液。